लेसर-हीटेड सोन्याच्या नॅनोकणांसह विट्रोमध्ये उच्च तापमानावरील जीवनाचे निरीक्षण केले जाते

Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये मर्यादित CSS सपोर्ट आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा). दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही साइटला शैली आणि JavaScript शिवाय रेंडर करू.
थर्मोफाइल्स हे सूक्ष्मजीव आहेत जे उच्च तापमानात वाढतात. त्यांचा अभ्यास केल्याने जीवन अत्यंत परिस्थितीशी कसे जुळवून घेते याबद्दल मौल्यवान माहिती मिळू शकते. तथापि, पारंपारिक ऑप्टिकल सूक्ष्मदर्शकासह उच्च तापमान परिस्थिती प्राप्त करणे कठीण आहे. स्थानिक प्रतिरोधक इलेक्ट्रिकल हीटिंगवर आधारित अनेक घरगुती उपाय प्रस्तावित केले गेले आहेत, परंतु कोणताही साधा व्यावसायिक उपाय नाही. या पेपरमध्ये, आम्ही वापरकर्त्याचे वातावरण सौम्य ठेवताना थर्मोफाइल अभ्यासासाठी उच्च तापमान प्रदान करण्यासाठी सूक्ष्मदर्शक क्षेत्रावर मायक्रोस्केल लेसर हीटिंगची संकल्पना सादर केली आहे. बायोकॉम्पॅटिबल आणि कार्यक्षम प्रकाश शोषक म्हणून सोन्याच्या नॅनोपार्टिकल लेपित सब्सट्रेटचा वापर करून मध्यम लेसर तीव्रतेवर मायक्रोस्केल हीटिंग मिळवता येते. मायक्रोस्केल फ्लुइड कन्व्हेक्शन, सेल रिटेन्शन आणि सेंट्रीफ्यूगल थर्मोफोरेटिक मोशनच्या संभाव्य प्रभावांवर चर्चा केली आहे. ही पद्धत दोन प्रजातींमध्ये प्रदर्शित केली गेली आहे: (i) जिओबॅसिलस स्टीरोथर्मोफिलस, एक सक्रिय थर्मोफिलिक जीवाणू जो सुमारे 65°C तापमानात पुनरुत्पादित होतो, ज्याचे आम्ही सूक्ष्म तापमानात उगवण, वाढ आणि पोहणे पाहिले आहे; (ii) थिओबॅसिलस एसपी., एक इष्टतम हायपरथर्मोफिलिक आर्किया. 80°C वर. हे काम आधुनिक आणि स्वस्त मायक्रोस्कोपी साधनांचा वापर करून थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीवांचे सोपे आणि सुरक्षित निरीक्षण करण्याचा मार्ग मोकळा करते.
कोट्यवधी वर्षांमध्ये, पृथ्वीवरील जीवन विविध प्रकारच्या पर्यावरणीय परिस्थितींशी जुळवून घेण्यासाठी विकसित झाले आहे ज्यांना कधीकधी आपल्या मानवी दृष्टीकोनातून अत्यंत गंभीर मानले जाते. विशेषतः, थर्मोफिलिक नावाचे काही थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीव (बॅक्टेरिया, आर्किया, बुरशी) तापमानाच्या श्रेणीत 45°C ते 122°C1, 2, 3, 4 पर्यंत वाढतात. थर्मोफाइल्स विविध परिसंस्थांमध्ये राहतात, जसे की खोल समुद्रातील हायड्रोथर्मल व्हेंट्स, हॉट स्प्रिंग किंवा ज्वालामुखी क्षेत्र. त्यांच्या संशोधनाने गेल्या काही दशकांमध्ये किमान दोन कारणांसाठी खूप उत्सुकता निर्माण केली आहे. प्रथम, आपण त्यांच्याकडून शिकू शकतो, उदाहरणार्थ, थर्मोफाइल्स 5, 6, एन्झाईम्स 7, 8 आणि मेम्ब्रेन्स 9 इतक्या उच्च तापमानात कसे स्थिर असतात किंवा थर्मोफाइल्स किरणोत्सर्गाच्या अत्यंत पातळीला कसे तोंड देऊ शकतात. दुसरे, ते इंधन उत्पादन13,14,15,16, रासायनिक संश्लेषण (डायहायड्रो, अल्कोहोल, मिथेन, अमीनो ऍसिड इ.)17, बायोमायनिंग18 आणि थर्मोस्टेबल बायोकॅटलिस्ट्स 7,11, यांसारख्या महत्त्वाच्या जैवतंत्रज्ञानाच्या 1,11,12 अनुप्रयोगांसाठी आधार आहेत. 13. विशेषतः, सध्याच्या सुप्रसिद्ध पॉलिमरेझ चेन रिॲक्शन (PCR)19 मध्ये थर्मोफिलिक बॅक्टेरियम थर्मस ॲक्वाटिकसपासून वेगळे केलेले एन्झाइम (Taq पॉलिमरेझ) समाविष्ट आहे, शोधल्या गेलेल्या पहिल्या थर्मोफाइल्सपैकी एक.
तथापि, थर्मोफाइल्सचा अभ्यास करणे सोपे काम नाही आणि कोणत्याही जैविक प्रयोगशाळेत ते सुधारले जाऊ शकत नाही. विशेषत:, जिवंत थर्मोफाइल्स कोणत्याही मानक प्रकाश सूक्ष्मदर्शकासह विट्रोमध्ये पाहिले जाऊ शकत नाहीत, अगदी व्यावसायिकरित्या उपलब्ध हीटिंग चेंबर्ससह, सामान्यत: 40 डिग्री सेल्सियस इतके कमी तापमानासाठी रेट केले जाते. 1990 च्या दशकापासून, केवळ काही संशोधन गटांनी उच्च-तापमान मायक्रोस्कोपी (HTM) प्रणालीच्या परिचयासाठी स्वतःला समर्पित केले आहे. 1994 मध्ये Glukh et al. हीटिंग/कूलिंग चेंबरची कल्पना पेल्टियर सेलच्या वापरावर आधारित आहे जी ॲनारोबिसिटी 20 राखण्यासाठी बंद केलेल्या आयताकृती केशिकाचे तापमान नियंत्रित करते. हे उपकरण 2 °C/s दराने 100 °C पर्यंत गरम केले जाऊ शकते, ज्यामुळे लेखकांना हायपरथर्मोफिलिक बॅक्टेरियम थर्मोटोगा मॅरिटिमा21 च्या गतिशीलतेचा अभ्यास करता येतो. 1999 मध्ये हॉर्न एट अल. सेल डिव्हिजन/कनेक्शनचा अभ्यास करण्यासाठी व्यावसायिक मायक्रोस्कोपीसाठी योग्य गरम केशिका वापरण्यावर आधारित, अगदी तत्सम उपकरण विकसित केले गेले आहे. प्रदीर्घ कालावधीच्या सापेक्ष निष्क्रियतेनंतर, 2012 मध्ये प्रभावी एचटीएमचा शोध पुन्हा सुरू झाला, विशेषत: हॉर्न एट अल यांनी शोधलेल्या उपकरणाचा वापर करणाऱ्या विर्थ गटाच्या कागदपत्रांच्या मालिकेशी संबंधित. पंधरा वर्षांपूर्वी, हायपरथर्मोफाइल्ससह मोठ्या संख्येने आर्किआच्या गतिशीलतेचा, तापलेल्या केशिका 23,24 वापरून 100 डिग्री सेल्सिअस तापमानात अभ्यास केला गेला. त्यांनी मूळ सूक्ष्मदर्शकामध्ये जलद गरम (सेट तापमानापर्यंत पोहोचण्यासाठी 35 मिनिटांऐवजी अनेक मिनिटे) आणि संपूर्ण माध्यमात 2 सेंटीमीटरपेक्षा जास्त रेषीय तापमान ग्रेडियंट प्राप्त करण्यासाठी सुधारित केले. हे तापमान ग्रेडियंट शेपिंग डिव्हाइस (TGFD) जैविक दृष्ट्या संबंधित अंतरावर तापमान ग्रेडियंटमधील अनेक थर्मोफाइल्सच्या गतिशीलतेचा अभ्यास करण्यासाठी वापरले गेले आहे 24, 25.
बंद केशिका गरम करणे हा थेट थर्मोफाइल्सचे निरीक्षण करण्याचा एकमेव मार्ग नाही. 2012 मध्ये, कुवाबारा आणि इतर. उष्णता-प्रतिरोधक चिकटवता (सुपर X2; सेमेडीन, जपान) सह सीलबंद घरगुती डिस्पोजेबल पायरेक्स चेंबर्स वापरण्यात आले. नमुने व्यावसायिकरित्या उपलब्ध पारदर्शक हीटिंग प्लेटवर (मायक्रो हीट प्लेट, किटाझाटो कॉर्पोरेशन, जपान) 110 डिग्री सेल्सिअस पर्यंत गरम करण्यास सक्षम, परंतु मूळतः बायोइमेजिंगसाठी हेतू नसलेले ठेवले होते. लेखकांनी 65 डिग्री सेल्सिअस तापमानात ॲनारोबिक थर्मोफिलिक बॅक्टेरिया (थर्मोसिफो ग्लोबिफॉर्मन्स, दुप्पट वेळ 24 मिनिटे) चे कार्यक्षम विभाजन पाहिले. 2020 मध्ये, पुलशेन एट अल. व्यावसायिक मेटल डिशेस (AttofluorTM, Thermofisher) चे कार्यक्षम हीटिंग दोन घरगुती गरम घटक वापरून प्रदर्शित केले गेले: एक झाकण आणि एक स्टेज (PCR मशीन-प्रेरित कॉन्फिगरेशन). या संबंधाचा परिणाम एकसमान द्रव तापमानात होतो आणि झाकणाच्या तळाशी बाष्पीभवन आणि संक्षेपण प्रतिबंधित करते. ओ-रिंगचा वापर पर्यावरणासह गॅस एक्सचेंज टाळतो. सल्फोस्कोप नावाच्या या एचटीएमचा वापर सल्फोलोबस ॲसिडोकॅल्डेरियस 75°C27 वर प्रतिमा करण्यासाठी केला गेला.
या सर्व प्रणालींची एक मान्यताप्राप्त मर्यादा म्हणजे हवेच्या उद्दिष्टांच्या वापरावर निर्बंध, कोणतेही तेल विसर्जन अशा उच्च तापमानासाठी आणि >1-मिमी जाड पारदर्शक नमुन्यांद्वारे इमेजिंगसाठी अनुपयुक्त आहे. या सर्व प्रणालींची एक मान्यताप्राप्त मर्यादा म्हणजे हवेच्या उद्दिष्टांच्या वापरावर निर्बंध, कोणतेही तेल विसर्जन अशा उच्च तापमानासाठी आणि >1-मिमी जाड पारदर्शक नमुन्यांद्वारे इमेजिंगसाठी अनुपयुक्त आहे. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, поскольбективов, посех этих систем в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образцы толщиной > 1 या सर्व प्रणालींची एक मान्यताप्राप्त कमतरता म्हणजे हवेच्या उद्दिष्टांच्या वापरावरील मर्यादा, कारण कोणतेही तेल विसर्जन इतक्या उच्च तापमानासाठी आणि पारदर्शक नमुन्यांद्वारे 1 मिमी जाडीच्या दृश्यासाठी योग्य नव्हते.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜,任何油浸都不适合这样都不镜厚的透明样品成像. या सर्व सिस्टीमची एक मान्यताप्राप्त मर्यादा म्हणजे एअर-ट्रेन केलेला आरसा वापरण्याची मर्यादा आहे, कारण कोणतेही तेल विसर्जन पारदर्शक नमुने इमेजिंगसाठी अयोग्य आहे > 1 मिमी जाडी इतक्या उच्च तापमानात. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, любовективов сло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм. या सर्व प्रणालींचा एक ओळखला जाणारा दोष म्हणजे एअर लेन्सचा मर्यादित वापर, कोणत्याही तेलाचे विसर्जन अशा उच्च तापमानासाठी अयोग्य आहे आणि पारदर्शक नमुने> 1 मिमी जाडीद्वारे दृश्यमान आहे.अगदी अलीकडे, ही मर्यादा चार्ल्स-ओर्झाग इत्यादींनी उठवली होती. 28, ज्यांनी एक असे उपकरण विकसित केले जे यापुढे स्वारस्याच्या प्रणालीभोवती उष्णता प्रदान करते, परंतु कव्हर ग्लासच्या आत, आयटीओ (इंडियम-टिन ऑक्साईड) च्या रेझिस्टरच्या पातळ पारदर्शक थराने झाकलेले आहे. पारदर्शक थरातून विद्युत प्रवाह देऊन झाकण 75°C पर्यंत गरम करता येते. तथापि, लेखकाने लेन्सला उद्दिष्टापर्यंत गरम केले पाहिजे, परंतु 65 डिग्री सेल्सियसपेक्षा जास्त नाही, जेणेकरून त्याचे नुकसान होऊ नये.
ही कामे दर्शवितात की कार्यक्षम उच्च-तापमान ऑप्टिकल मायक्रोस्कोपीचा विकास मोठ्या प्रमाणावर केला गेला नाही, बहुतेकदा घरगुती उपकरणे आवश्यक असतात आणि बहुतेक वेळा स्थानिक रिझोल्यूशनच्या खर्चावर साध्य केले जातात, जे थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीव काही पेक्षा मोठे नसल्यामुळे एक गंभीर गैरसोय आहे. मायक्रोमीटर HTM च्या तीन अंतर्निहित समस्यांचे निराकरण करण्यासाठी हीटिंग व्हॉल्यूम कमी करणे ही गुरुकिल्ली आहे: खराब अवकाशीय रिझोल्यूशन, सिस्टम गरम झाल्यावर उच्च थर्मल जडत्व आणि अति तापमानात आसपासच्या घटकांना (विसर्जन तेल, वस्तुनिष्ठ लेन्स… किंवा वापरकर्त्याचे हात) हानिकारक गरम करणे. ).
या पेपरमध्ये, आम्ही थर्मोफाइल निरीक्षणासाठी एचटीएम सादर करतो जो प्रतिरोधक हीटिंगवर आधारित नाही. त्याऐवजी, प्रकाश-शोषक सब्सट्रेटच्या लेसर विकिरणाने आम्ही सूक्ष्मदर्शकाच्या दृश्य क्षेत्राच्या मर्यादित क्षेत्रामध्ये स्थानिकीकृत गरम केले. परिमाणवाचक फेज मायक्रोस्कोपी (QPM) वापरून तापमान वितरण व्हिज्युअलाइज केले गेले. या पद्धतीची परिणामकारकता जिओबॅसिलस स्टीरोथर्मोफिलस, एक गतिमान थर्मोफिलिक जीवाणू जो सुमारे 65 डिग्री सेल्सिअस तापमानात पुनरुत्पादित होतो आणि कमी दुप्पट वेळ (सुमारे 20 मिनिटे) आणि सल्फोलोबस शिबाटे, एक हायपरथर्मोफाइल द्वारे दर्शविला जातो जो चांगल्या प्रकारे वाढतो (80 डिग्री सेल्सियस) स्पष्ट करण्यासाठी. तापमानाचे कार्य म्हणून सामान्य प्रतिकृती दर आणि पोहणे पाहण्यात आले. हे लेसर HTM (LA-HTM) कव्हरस्लिपच्या जाडीने किंवा उद्दिष्टाच्या स्वरूपानुसार (हवा किंवा तेल विसर्जन) मर्यादित नाही. हे बाजारातील कोणत्याही उच्च रिझोल्यूशन लेन्सचा वापर करण्यास अनुमती देते. थर्मल जडत्वामुळे (मिलीसेकंद स्केलवर झटपट गरम होते) यामुळे स्लो हीटिंगचा त्रास होत नाही आणि केवळ व्यावसायिकरित्या उपलब्ध घटक वापरतात. फक्त नवीन सुरक्षितता चिंता उपकरणाच्या आत आणि शक्यतो डोळ्यांद्वारे शक्तिशाली लेसर बीम (सामान्यत: 100 mW पर्यंत) च्या उपस्थितीशी संबंधित आहेत, ज्यासाठी संरक्षणात्मक गॉगल आवश्यक आहेत.
LA-HTM चे तत्व म्हणजे सूक्ष्मदर्शकाच्या दृश्याच्या क्षेत्रामध्ये स्थानिक पातळीवर नमुना गरम करण्यासाठी लेसर वापरणे (Fig. 1a). हे करण्यासाठी, नमुना प्रकाश-शोषक असणे आवश्यक आहे. वाजवी लेसर पॉवर (100 mW पेक्षा कमी) वापरण्यासाठी, आम्ही द्रव माध्यमाद्वारे प्रकाशाच्या शोषणावर विसंबून राहिलो नाही, परंतु कृत्रिमरित्या सोन्याचे नॅनोकण (Fig. 1c) सह सब्सट्रेट लेप करून नमुना शोषण वाढवले. बायोमेडिसिन, नॅनोकेमिस्ट्री किंवा सूर्यप्रकाश कापणी 29,30,31 मध्ये अपेक्षित अनुप्रयोगांसह, थर्मल प्लास्मोनिक्सच्या क्षेत्रासाठी प्रकाशासह सोन्याचे नॅनो कण गरम करणे मूलभूत महत्त्व आहे. गेल्या काही वर्षांत, आम्ही भौतिकशास्त्र, रसायनशास्त्र आणि जीवशास्त्रातील थर्मल प्लाझ्मा अनुप्रयोगांशी संबंधित अनेक अभ्यासांमध्ये या LA-HTM चा वापर केला आहे. या पद्धतीतील मुख्य अडचण अंतिम तापमान प्रोफाइल प्रदर्शित करणे आहे, कारण भारदस्त तापमान नमुन्यातील मायक्रोस्केल क्षेत्रापुरते मर्यादित आहे. आम्ही दर्शविले आहे की तापमान मॅपिंग चार-तरंगलांबी ट्रान्सव्हर्स शीअर इंटरफेरोमीटरने साध्य केले जाऊ शकते, एक साधी, उच्च-रिझोल्यूशन, आणि द्विमितीय विवर्तन ग्रेटिंग्सच्या वापरावर आधारित परिमाणात्मक फेज मायक्रोस्कोपीची अत्यंत संवेदनशील पद्धत (ज्याला क्रॉस ग्रेटिंग देखील म्हणतात) 33,34,35,36. क्रॉस ग्रेटिंग वेव्हफ्रंट मायक्रोस्कोपी (CGM) वर आधारित या थर्मल मायक्रोस्कोपी तंत्राची विश्वासार्हता गेल्या दशकभरात प्रकाशित झालेल्या 37,38,39,40,41,42,43 डझनभर पेपर्समध्ये दिसून आली आहे.
समांतर लेसर हीटिंग, आकार आणि तापमान सूक्ष्मदर्शकाच्या स्थापनेची योजना. b नमुना भूमिती ज्यामध्ये ॲटोफ्लुओरटीएम चेंबर असते ज्यामध्ये सोन्याच्या नॅनोकणांनी लेपित कव्हरस्लिप असते. c नमुन्याकडे बारकाईने पहा (स्केल करण्यासाठी नाही). d हे एकसमान लेसर बीम प्रोफाइल आणि (e) सोन्याच्या नॅनो कणांच्या नमुना समतल तपमानाचे अनुकरण केलेले त्यानंतरचे तापमान वितरणाचे प्रतिनिधित्व करते. f हे कंकणाकृती लेसर बीम प्रोफाइल आहे जे (g) मध्ये दर्शविलेल्या परिणामी तापमान वितरणाच्या सिम्युलेशनमध्ये दर्शविल्याप्रमाणे एकसमान तापमान निर्माण करण्यासाठी योग्य आहे. स्केल बार: 30 µm.
विशेषतः, आम्ही अलीकडेच LA-HTM आणि CGM सह सस्तन प्राण्यांच्या पेशींना गरम केले आणि 37-42°C च्या श्रेणीमध्ये सेल्युलर उष्मा शॉक प्रतिसादांचा मागोवा घेतला, जे या तंत्राची एकल जिवंत पेशी इमेजिंगसाठी उपयुक्तता दर्शविते. तथापि, उच्च तापमानात सूक्ष्मजीवांच्या अभ्यासासाठी एलए-एचटीएमचा वापर अस्पष्ट नाही, कारण सस्तन प्राण्यांच्या पेशींच्या तुलनेत अधिक सावधगिरी बाळगणे आवश्यक आहे: प्रथम, मध्यम तळाला दहा अंशांनी (काही अंशांऐवजी) गरम केल्याने होते. मजबूत उभ्या तापमान ग्रेडियंटपर्यंत. द्रव संवहन 44 तयार करू शकते जे, जर सब्सट्रेटला घट्टपणे जोडलेले नसेल तर, अवांछित हालचाल आणि जीवाणूंचे मिश्रण होऊ शकते. द्रव थराची जाडी कमी करून हे संवहन दूर केले जाऊ शकते. या उद्देशासाठी, खाली सादर केलेल्या सर्व प्रयोगांमध्ये, मेटल कप (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c) मध्ये ठेवलेल्या अंदाजे 15 µm जाडीच्या दोन कव्हरस्लिप्समध्ये बॅक्टेरियाचे निलंबन ठेवण्यात आले होते. तत्वतः, जर द्रवाची जाडी हीटिंग लेसरच्या बीमच्या आकारापेक्षा लहान असेल तर संवहन टाळता येऊ शकते. दुसरे म्हणजे, अशा मर्यादित भूमितीमध्ये काम केल्याने एरोबिक जीव गुदमरू शकतात (चित्र S2 पहा). ऑक्सिजन (किंवा इतर कोणत्याही महत्वाच्या वायूला) झिरपणाऱ्या सब्सट्रेटचा वापर करून, कव्हरस्लिपमध्ये अडकलेले हवेचे बुडबुडे सोडून किंवा वरच्या कव्हरस्लिपमध्ये छिद्र पाडून (चित्र S1 पहा) 45 ही समस्या टाळता येते. या अभ्यासात, आम्ही नंतरचे उपाय निवडले (आकडे 1b आणि S1). शेवटी, लेसर हीटिंग समान तापमान वितरण प्रदान करत नाही. लेसर किरण (चित्र 1d) च्या समान तीव्रतेवर देखील, तापमान वितरण एकसमान नसते, उलट थर्मल डिफ्यूजनमुळे (Fig. 1e) गॉसियन वितरणासारखे असते. जेव्हा जैविक प्रणालींचा अभ्यास करण्यासाठी दृश्याच्या क्षेत्रात अचूक तापमान स्थापित करणे हे ध्येय असते, तेव्हा असमान प्रोफाइल आदर्श नसतात आणि जर ते सब्सट्रेटला चिकटत नसतील तर ते जीवाणूंच्या थर्मोफोरेटिक हालचालींना कारणीभूत ठरू शकतात (चित्र S3, S4 पहा)39. यासाठी, दिलेल्या भौमितिक क्षेत्रामध्ये एकसमान तपमानाचे वितरण साध्य करण्यासाठी, नमुन्याच्या समतलातील अंगठीच्या आकारानुसार (चित्र 1f) अवरक्त लेसर बीमला आकार देण्यासाठी आम्ही अवकाशीय प्रकाश मॉड्युलेटर (SLM) वापरला, थर्मल डिफ्यूजन असूनही (Fig. 1d) 39 , 42, 46. माध्यमाचे बाष्पीभवन टाळण्यासाठी धातूच्या डिशवर (आकृती 1b) वरची कव्हरस्लिप ठेवा आणि किमान काही दिवस निरीक्षण करा. ही शीर्ष कव्हरस्लिप सील केलेली नसल्यामुळे, आवश्यक असल्यास अतिरिक्त माध्यम सहजपणे जोडले जाऊ शकते.
LA-HTM कसे कार्य करते हे स्पष्ट करण्यासाठी आणि थर्मोफिलिक संशोधनामध्ये त्याची उपयुक्तता प्रदर्शित करण्यासाठी, आम्ही एरोबिक बॅक्टेरिया जिओबॅसिलस स्टीरोथर्मोफिलसचा अभ्यास केला, ज्याचे इष्टतम वाढ तापमान सुमारे 60-65°C आहे. बॅक्टेरियममध्ये फ्लॅगेला आणि पोहण्याची क्षमता देखील असते, जी सामान्य सेल्युलर क्रियाकलापांचे आणखी एक सूचक प्रदान करते.
नमुने (Fig. 1b) एका तासासाठी 60°C वर पूर्व-उष्मायन केले गेले आणि नंतर LA-HTM नमुना धारकामध्ये ठेवले गेले. हे प्री-इन्क्युबेशन दोन कारणांसाठी ऐच्छिक आहे, परंतु तरीही उपयुक्त आहे: प्रथम, लेसर चालू केल्यावर, त्यामुळे पेशी लगेच वाढतात आणि विभाजित होतात (पूरक सामग्रीमध्ये M1 चित्रपट पहा). प्री-इनक्युबेशनशिवाय, प्रत्येक वेळी नमुन्यावर नवीन पाहण्याचे क्षेत्र गरम केल्यावर बॅक्टेरियाच्या वाढीस साधारणपणे 40 मिनिटे उशीर होतो. दुसरे, 1 तासाच्या प्री-इन्क्युबेशनने कव्हरस्लिपवर बॅक्टेरिया चिकटून राहण्यास प्रोत्साहन दिले, लेसर चालू असताना थर्मोफोरेसीसमुळे पेशींना दृश्य क्षेत्राबाहेर जाण्यापासून प्रतिबंधित केले (पूरक सामग्रीमध्ये M2 चित्रपट पहा). थर्मोफोरेसीस म्हणजे तापमान ग्रेडियंटसह कण किंवा रेणूंची हालचाल, सामान्यतः गरम ते थंड, आणि जीवाणू अपवाद नाहीत 43,47. लेसर बीमला आकार देण्यासाठी आणि सपाट तापमान वितरण प्राप्त करण्यासाठी SLM वापरून दिलेल्या क्षेत्रावरील हा अनिष्ट परिणाम काढून टाकला जातो.
अंजीर वर. आकृती 2 कंकणाकृती लेसर बीम (चित्र 1f) सह सोन्याच्या नॅनोकणांनी लेपित ग्लास सब्सट्रेटचे विकिरण करून CGM द्वारे मोजलेले तापमान वितरण दर्शविते. लेसर बीमने व्यापलेल्या संपूर्ण क्षेत्रावर सपाट तापमानाचे वितरण दिसून आले. हे क्षेत्र 65°C वर सेट केले गेले होते, इष्टतम वाढीचे तापमान. या प्रदेशाच्या बाहेर, तापमान वक्र नैसर्गिकरित्या \(1/r\) (जेथे \(r\) रेडियल समन्वय आहे) वर येते.
गोलाकार क्षेत्रावर सपाट तापमान प्रोफाइल मिळविण्यासाठी सोन्याच्या नॅनोकणांच्या थराला विकिरण करण्यासाठी कंकणाकृती लेसर बीम वापरून प्राप्त केलेला CGM मापनांचा तापमान नकाशा. b तापमान नकाशाचे समथर्म (a). लेसर बीमचा समोच्च राखाडी ठिपके असलेल्या वर्तुळाद्वारे दर्शविला जातो. प्रयोग दोनदा पुनरावृत्ती झाला (पूरक साहित्य, आकृती S4 पहा).
LA-HTM वापरून बॅक्टेरियाच्या पेशींच्या व्यवहार्यतेचे अनेक तास निरीक्षण केले गेले. अंजीर वर. 3 3 तास 20 मिनिटांच्या चित्रपटातून घेतलेल्या चार प्रतिमांसाठी वेळ मध्यांतर दाखवते (चित्रपट M3, पूरक माहिती). लेसरने परिभाषित केलेल्या वर्तुळाकार क्षेत्रामध्ये जिवाणू सक्रियपणे वाढताना आढळून आले जेथे तापमान इष्टतम होते, 65°C पर्यंत पोहोचते. याउलट, जेव्हा तापमान 10 s साठी 50°C पेक्षा कमी होते तेव्हा पेशींची वाढ लक्षणीयरीत्या कमी होते.
G. स्टीरोथर्मोफिलस बॅक्टेरियाच्या ऑप्टिकल खोलीच्या प्रतिमा वेगवेगळ्या वेळी लेसर हीटिंगनंतर वाढतात, (a) t = 0 मि, (b) 1 ता 10 मि, (c) 2 ता 20 मि, (d) 3 तास 20 मि. 200 संबंधित तापमान नकाशावर सुपरइम्पोज केलेल्या एका मिनिटाच्या फिल्ममधून (पूरक माहितीमध्ये प्रदान केलेली M3 फिल्म) काढलेली. लेसर वेळेवर चालू होतो \(t=0\). तीव्रतेच्या प्रतिमेमध्ये आइसोथर्म्स जोडले गेले आहेत.
पेशींची वाढ आणि तपमानावरील त्याचे अवलंबित्व यांचे आणखी प्रमाण निश्चित करण्यासाठी, आम्ही मूव्ही एम3 फील्ड ऑफ व्ह्यू (चित्र 4) मध्ये सुरुवातीला पृथक जीवाणूंच्या विविध वसाहतींच्या बायोमासमध्ये वाढ मोजली. मिनी कॉलनी फॉर्मिंग युनिट (mCFU) निर्मितीच्या प्रारंभी निवडलेले मूळ जीवाणू आकृती S6 मध्ये दर्शविले आहेत. कोरड्या वस्तुमानाची मोजमाप CGM 48 कॅमेऱ्याने घेतली गेली जी तापमान वितरणाचा नकाशा बनवण्यासाठी वापरली गेली. कोरडे वजन आणि तापमान मोजण्यासाठी CGM ची क्षमता ही LA-HTM ची ताकद आहे. अपेक्षेप्रमाणे, उच्च तापमानामुळे जिवाणूंची जलद वाढ होते (Fig. 4a). अंजीर 4b मधील सेमी-लॉग प्लॉटमध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, सर्व तापमानातील वाढ ही घातांकीय वाढीचे अनुसरण करते, जेथे डेटा घातांकीय कार्य वापरतो \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), जेथे \(\tau {{{{\rm{log }}}}}}2\) – पिढी वेळ (किंवा दुप्पट वेळ), \( g =1/ \tau\) - वाढीचा दर (प्रति युनिट वेळेत विभागांची संख्या). अंजीर वर. 4c तापमानाचे कार्य म्हणून संबंधित वाढीचा दर आणि निर्मिती वेळ दर्शवते. वेगाने वाढणारे mCFU हे दोन तासांनंतर वाढीच्या संपृक्ततेद्वारे वैशिष्ट्यीकृत आहेत, उच्च जिवाणू घनतेमुळे अपेक्षित वर्तन (शास्त्रीय द्रव संस्कृतींमध्ये स्थिर अवस्थेसारखे). सामान्य आकार \(g\left(T\उजवीकडे)\) (Fig. 4c) G. स्टीरोथर्मोफिलससाठी अपेक्षित दोन-फेज वक्र 60-65°C च्या इष्टतम वाढ दराशी संबंधित आहे. कार्डिनल मॉडेल (आकृती S5)49 वापरून डेटा जुळवा जेथे \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt}}} ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, जे साहित्यात उद्धृत केलेल्या इतर मूल्यांशी चांगले सहमत आहे49. जरी तापमान अवलंबून मापदंड पुनरुत्पादक असले तरी, \({G}_{0}\) चा कमाल वाढीचा दर एका प्रयोगानुसार बदलू शकतो (आकडे S7-S9 आणि चित्रपट M4 पहा). तापमान फिटिंग पॅरामीटर्सच्या उलट, जे सार्वत्रिक असावे, जास्तीत जास्त वाढीचा दर निरीक्षण केलेल्या मायक्रोस्केल भूमितीमधील माध्यमाच्या गुणधर्मांवर (पोषक घटकांची उपलब्धता, ऑक्सिजन एकाग्रता) अवलंबून असतो.
विविध तापमानात सूक्ष्मजीव वाढ. mCFU: लघु वसाहत तयार करणारे युनिट. तापमान ग्रेडियंट (चित्रपट M3) मध्ये वाढणाऱ्या एका जीवाणूच्या व्हिडिओवरून डेटा मिळवला. b समान (a), अर्ध-लोगॅरिदमिक स्केल. c वाढीचा दर\(\tau\) आणि जनरेशन वेळ\(g\) रेखीय प्रतिगमन (b) वरून मोजला जातो. क्षैतिज त्रुटी पट्ट्या: तापमान श्रेणी ज्यावर mCFUs वाढीच्या दरम्यान दृश्याच्या क्षेत्रात विस्तारले. अनुलंब त्रुटी बार: रेखीय प्रतिगमन मानक त्रुटी.
सामान्य वाढीव्यतिरिक्त, काही बॅक्टेरिया कधीकधी लेझर हीटिंग दरम्यान दृश्यात तरंगतात, जे फ्लॅगेला असलेल्या जीवाणूंसाठी एक अपेक्षित वर्तन आहे. अतिरिक्त माहितीमधील M5 चित्रपट अशा प्रकारच्या पोहण्याच्या क्रियाकलाप दर्शवितो. या प्रयोगात, आकृती 1d, e आणि S3 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, तापमान ग्रेडियंट तयार करण्यासाठी एकसमान लेसर रेडिएशन वापरण्यात आले. आकृती 5 M5 मूव्हीमधून निवडलेल्या दोन प्रतिमा क्रम दर्शविते की एक जीवाणू दिशात्मक हालचाल प्रदर्शित करतो तर इतर सर्व जीवाणू गतिहीन राहतात.
दोन वेळ फ्रेम (a) आणि (b) ठिपके असलेल्या वर्तुळांनी चिन्हांकित केलेल्या दोन भिन्न जीवाणूंचे पोहणे दर्शवितात. प्रतिमा M5 चित्रपटातून काढल्या गेल्या आहेत (पूरक साहित्य म्हणून प्रदान केलेले).
G. स्टीरोथर्मोफिलसच्या बाबतीत, लेसर बीम चालू झाल्यानंतर काही सेकंदांनी जीवाणूंची सक्रिय हालचाल (चित्र 5) सुरू झाली. हे निरीक्षण या थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीवाच्या तापमानात वाढ होण्याच्या तात्पुरत्या प्रतिसादावर जोर देते, जसे की मोरा एट अल यांनी आधीच निरीक्षण केले आहे. २४ . LA-HTM वापरून बॅक्टेरियाच्या गतिशीलतेचा आणि थर्मोटॅक्सिसचा विषय आणखी शोधला जाऊ शकतो.
सूक्ष्मजीव पोहणे इतर प्रकारच्या शारीरिक हालचालींशी गोंधळून जाऊ नये, म्हणजे (i) ब्राउनियन गती, जी निश्चित दिशा नसलेली गोंधळलेली गती दिसते, (ii) संवहन 50 आणि थर्मोफोरेसीस 43, ज्यामध्ये तापमानासह गती नियमित प्रवाहात असते. ग्रेडियंट
G. स्टीरोथर्मोफिलस हे संरक्षण म्हणून प्रतिकूल पर्यावरणीय परिस्थितीच्या संपर्कात असताना अत्यंत प्रतिरोधक बीजाणू (बीजाणु निर्मिती) निर्माण करण्याच्या क्षमतेसाठी ओळखले जाते. जेव्हा पर्यावरणीय परिस्थिती पुन्हा अनुकूल बनते, तेव्हा बीजाणू उगवतात, जिवंत पेशी तयार करतात आणि वाढ पुन्हा सुरू करतात. ही स्पोर्युलेशन/उगवण प्रक्रिया सर्वश्रुत असली तरी ती वास्तविक वेळेत कधीच दिसून आली नाही. LA-HTM वापरून, आम्ही येथे G. स्टीरोथर्मोफिलसमधील उगवण घटनांचे पहिले निरीक्षण नोंदवत आहोत.
अंजीर वर. 6a 13 बीजाणूंचा CGM संच वापरून प्राप्त केलेल्या ऑप्टिकल डेप्थ (OT) च्या टाइम-लॅप्स प्रतिमा दर्शविते. संपूर्ण संकलन वेळेसाठी (15 तास 6 मिनिटे, \(t=0\) - लेसर हीटिंगची सुरुवात), 13 पैकी 4 बीजाणू अंकुरित झाले, लागोपाठ वेळ बिंदू \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' आणि \(11\) h \(30\)'. यापैकी फक्त एक घटना आकृती 6 मध्ये दर्शविली असली तरी, M6 चित्रपटात पूरक सामग्रीमध्ये 4 उगवण घटना पाहिल्या जाऊ शकतात. विशेष म्हणजे, उगवण यादृच्छिक असल्याचे दिसून येते: सर्व बीजाणू अंकुरित होत नाहीत आणि पर्यावरणीय परिस्थितीत समान बदल होत असतानाही एकाच वेळी अंकुर वाढू शकत नाहीत.
8 OT प्रतिमा (तेल विसर्जन, 60x, 1.25 NA उद्दिष्ट) आणि (b) जी. स्टीरोथर्मोफिलस समुच्चयांचे बायोमास उत्क्रांती असलेला काल-विराम. c (b) वाढ दराची रेखीयता (डॅश रेषा) हायलाइट करण्यासाठी अर्ध-लॉग स्केलवर काढले.
अंजीर वर. 6b,c डेटा संकलनाच्या संपूर्ण कालावधीत वेळेचे कार्य म्हणून दृश्याच्या क्षेत्रात सेल लोकसंख्येचे बायोमास दर्शविते. अंजीर मध्ये \(t=5\)h वाजता कोरड्या वस्तुमानाचा जलद क्षय दिसून आला. 6b, c, दृश्याच्या क्षेत्रातून काही पेशी बाहेर पडल्यामुळे. या चार घटनांचा वाढीचा दर \(0.77\pm 0.1\) h-1 आहे. हे मूल्य आकृती 3. 3 आणि 4 शी संबंधित वाढीच्या दरापेक्षा जास्त आहे, जेथे पेशी सामान्यपणे वाढतात. बीजाणूंमधून जी. स्टीरोथर्मोफिलसच्या वाढीच्या दराचे कारण अस्पष्ट आहे, परंतु हे मोजमाप LA-HTM ची आवड ठळक करतात आणि पेशी जीवनाच्या गतिशीलतेबद्दल अधिक जाणून घेण्यासाठी सिंगल सेल स्तरावर (किंवा एकल mCFU स्तरावर) कार्य करतात. .
LA-HTM ची अष्टपैलुत्व आणि उच्च तापमानात त्याची कार्यक्षमता आणखी दाखवण्यासाठी, आम्ही सल्फोलोबस शिबटे, हायपरथर्मोफिलिक ऍसिडोफिलिक आर्कियाच्या वाढीचे परीक्षण केले ज्याचे इष्टतम वाढ तापमान 80°C51 आहे. जी. स्टीरोथर्मोफिलसच्या तुलनेत, या आर्किआचे आकारविज्ञान खूप वेगळे आहे, जे लांबलचक रॉड्स (बॅसिली) ऐवजी 1 मायक्रॉन गोलाकार (कोकी) सारखे आहे.
आकृती 7a मध्ये CGM वापरून प्राप्त केलेल्या S. shibatae mCFU च्या अनुक्रमिक ऑप्टिकल खोलीच्या प्रतिमांचा समावेश आहे (पूरक सामग्रीमध्ये M7 फीचर फिल्म पहा). हे mCFU सुमारे 73°C वर वाढते, इष्टतम तापमान 80°C च्या खाली, परंतु सक्रिय वाढीसाठी तापमान श्रेणीमध्ये असते. आम्ही अनेक विखंडन घटनांचे निरीक्षण केले ज्यामुळे mCFU काही तासांनंतर आर्कियाच्या मायक्रोग्रेप्ससारखे दिसतात. या OT प्रतिमांमधून, mCFU बायोमास कालांतराने मोजले गेले आणि आकृती 7b मध्ये सादर केले गेले. विशेष म्हणजे, S. shibatae mCFUs ने G. स्टीरोथर्मोफिलस mCFUs सह घातांकीय वाढीपेक्षा रेखीय वाढ दर्शविली. पेशींच्या वाढीच्या दराच्या स्वरूपाविषयी दीर्घकाळ चर्चा झाली आहे. Tzur et al.53 द्वारे स्पष्ट केल्याप्रमाणे, घातांक आणि (द्वि) रेखीय वाढीमध्ये फरक करण्यासाठी बायोमास मोजमापांमध्ये <6% ची अचूकता आवश्यक आहे, जे बहुतेक QPM तंत्रांच्या आवाक्याबाहेर आहे, अगदी इंटरफेरोमेट्रीचा समावेश आहे. Tzur et al.53 द्वारे स्पष्ट केल्याप्रमाणे, घातांक आणि (द्वि) रेखीय वाढीमध्ये फरक करण्यासाठी बायोमास मोजमापांमध्ये <6% ची अचूकता आवश्यक आहे, जे बहुतेक QPM तंत्रांच्या आवाक्याबाहेर आहे, अगदी इंटरफेरोमेट्रीचा समावेश आहे. Как объяснили Цур и др.५३, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в измерениях бисмерениях бисмерениях бисмерениях биспоненциального льшинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Zur et al.53 द्वारे स्पष्ट केल्याप्रमाणे, घातांक आणि (द्वि) रेखीय वाढीमध्ये फरक करण्यासाठी बायोमास मोजमापांमध्ये <6% अचूकता आवश्यक आहे, जी इंटरफेरोमेट्री वापरूनही बहुतेक QPM पद्धतींसाठी अप्राप्य आहे.Zur et al द्वारे स्पष्ट केल्याप्रमाणे. 53, घातांकीय आणि (द्वि) रेखीय वाढ यांच्यातील फरक करण्यासाठी बायोमास मापनांमध्ये 6% पेक्षा कमी अचूकता आवश्यक आहे, जी इंटरफेरोमेट्री वापरली जात असतानाही, बहुतेक QPM पद्धतींसाठी अप्राप्य आहे. CGM ही अचूकता बायोमास मापनांमध्ये उप-पीजी अचूकतेसह प्राप्त करते 36,48.
6 OT प्रतिमा (तेल विसर्जन, 60x, NA उद्दिष्ट 1.25) आणि (b) CGM सह मोजलेले सूक्ष्म-CFU बायोमास उत्क्रांती असलेला काल-विराम. अधिक माहितीसाठी चित्रपट M7 पहा.
S. shibatae ची पूर्णपणे रेषीय वाढ अनपेक्षित होती आणि अद्याप नोंदवली गेली नाही. तथापि, घातांकीय वाढ अपेक्षित आहे, किमान कारण कालांतराने, 2, 4, 8, 16 … पेशींचे एकाधिक विभाजन होणे आवश्यक आहे. आम्ही असे गृहित धरले की दाट सेल पॅकिंगमुळे सेल प्रतिबंधामुळे रेषीय वाढ होऊ शकते, ज्याप्रमाणे सेलची वाढ मंदावते आणि शेवटी सेलची घनता खूप जास्त असते तेव्हा सुप्त स्थितीत पोहोचते.
आम्ही पुढील पाच स्वारस्याच्या मुद्द्यांवर चर्चा करून निष्कर्ष काढतो: हीटिंग व्हॉल्यूममध्ये घट, थर्मल जडत्व कमी करणे, सोन्याच्या नॅनोकणांमध्ये स्वारस्य, परिमाणवाचक टप्प्यातील सूक्ष्मदर्शकामध्ये स्वारस्य आणि संभाव्य तापमान श्रेणी ज्यामध्ये LA-HTM वापरला जाऊ शकतो.
रेझिस्टिव्ह हीटिंगच्या तुलनेत, HTM डेव्हलपमेंटसाठी वापरल्या जाणाऱ्या लेसर हीटिंगचे अनेक फायदे आहेत, जे आम्ही या अभ्यासात स्पष्ट करतो. विशेषतः, सूक्ष्मदर्शकाच्या दृश्याच्या क्षेत्रात द्रव माध्यमांमध्ये, हीटिंग व्हॉल्यूम काही (10 μm) 3 व्हॉल्यूममध्ये ठेवली जाते. अशा प्रकारे, केवळ निरीक्षण केलेले सूक्ष्मजंतू सक्रिय असतात, तर इतर जीवाणू सुप्त असतात आणि नमुन्याचा पुढील अभ्यास करण्यासाठी वापरला जाऊ शकतो - प्रत्येक वेळी नवीन तापमान तपासण्यासाठी नमुना बदलण्याची गरज नाही. याव्यतिरिक्त, मायक्रोस्केल हीटिंगमुळे तापमानाच्या मोठ्या श्रेणीचे थेट परीक्षण करण्याची परवानगी मिळते: आकृती 4c 3-तासांच्या चित्रपटातून (Movie M3) प्राप्त केली गेली होती, ज्यासाठी सहसा अनेक नमुने तयार करणे आणि तपासणी करणे आवश्यक असते – अभ्यासाधीन प्रत्येक नमुन्यासाठी एक. y हे तापमान आहे जे प्रयोगातील दिवसांची संख्या दर्शवते. गरम होणारे आवाज कमी केल्याने सूक्ष्मदर्शकाच्या आजूबाजूचे सर्व ऑप्टिकल घटक, विशेषत: वस्तुनिष्ठ लेन्स, खोलीच्या तपमानावर ठेवतात, जी आतापर्यंत समाजाला भेडसावणारी एक मोठी समस्या आहे. LA-HTM तेल विसर्जन लेन्ससह कोणत्याही लेन्ससह वापरले जाऊ शकते आणि दृश्याच्या क्षेत्रात अत्यंत तापमान असताना देखील खोलीच्या तापमानावर राहील. आम्ही या अभ्यासात नोंदवलेल्या लेझर हीटिंग पद्धतीची मुख्य मर्यादा ही आहे की ज्या पेशी चिकटत नाहीत किंवा तरंगत नाहीत ते दृश्य क्षेत्रापासून दूर आणि अभ्यास करणे कठीण असू शकतात. काही शंभर मायक्रॉनपेक्षा जास्त तापमानात वाढ होण्यासाठी कमी मॅग्निफिकेशन लेन्स वापरणे हा एक उपाय असू शकतो. ही खबरदारी स्थानिक रिझोल्यूशनमध्ये घट झाल्यामुळे आहे, परंतु जर लक्ष्य सूक्ष्मजीवांच्या हालचालींचा अभ्यास करणे असेल तर उच्च अवकाशीय रिझोल्यूशन आवश्यक नाही.
सिस्टीम गरम करण्यासाठी (आणि कूलिंग) वेळ स्केल \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}}}}}} {{{\mbox{D}}}}\) त्याच्या आकारावर अवलंबून आहे, कायद्यानुसार \({{{({\rm{\tau }}}}}}__{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), जेथे \ (L\ ) हा उष्णतेच्या स्त्रोताचा वैशिष्ट्यपूर्ण आकार आहे (आमच्या अभ्यासात लेसर बीमचा व्यास \(L\ सुमारे 100\) μm आहे), \(D\) पर्यावरणाची थर्मल डिफ्युसिव्हिटी आहे (आमच्यामध्ये सरासरी केस, ग्लास आणि वॉटर डिफ्यूजन रेट\(D\ बद्दल 2\fold {10}^{-7}\) m2/s). तापमानात बदल होणे अपेक्षित आहे, तापमान वाढीची ही तात्काळ स्थापना केवळ प्रयोगाचा कालावधी कमी करत नाही तर तापमानाच्या प्रभावाच्या कोणत्याही गतिमान अभ्यासासाठी अचूक वेळ \(t=0\) अनुमती देते.
आमची प्रस्तावित पद्धत कोणत्याही प्रकाश-शोषक सब्सट्रेटसाठी लागू आहे (उदाहरणार्थ, ITO कोटिंगसह व्यावसायिक नमुने). तथापि, सोन्याचे नॅनोकण हे इन्फ्रारेडमध्ये उच्च शोषण आणि दृश्यमान श्रेणीमध्ये कमी शोषण प्रदान करण्यास सक्षम आहेत, ज्यातील नंतरची वैशिष्ट्ये दृश्यमान श्रेणीतील प्रभावी ऑप्टिकल निरीक्षणासाठी स्वारस्यपूर्ण आहेत, विशेषत: फ्लोरोसेन्स वापरताना. याव्यतिरिक्त, सोने जैव सुसंगत आहे, रासायनिकदृष्ट्या निष्क्रिय आहे, ऑप्टिकल घनता 530 nm ते जवळच्या इन्फ्रारेडमध्ये समायोजित केली जाऊ शकते आणि नमुना तयार करणे सोपे आणि किफायतशीर आहे29.
ट्रान्सव्हर्स ग्रेटिंग वेव्हफ्रंट मायक्रोस्कोपी (सीजीएम) मायक्रोस्केलवर केवळ तापमान मॅपिंगच नाही तर बायोमास मॉनिटरिंगला देखील अनुमती देते, जे LA-HTM सह संयोजनात विशेषतः उपयुक्त (आवश्यक नसल्यास) बनवते. गेल्या दशकात, इतर तापमान मायक्रोस्कोपी तंत्रे विकसित केली गेली आहेत, विशेषत: बायोइमेजिंगच्या क्षेत्रात, आणि त्यापैकी बहुतेकांना तापमान-संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोब 54,55 वापरण्याची आवश्यकता आहे. तथापि, या पद्धतींवर टीका केली गेली आहे आणि काही अहवालांनी पेशींमध्ये तापमानातील अवास्तव बदल मोजले आहेत, शक्यतो फ्लूरोसेन्स तापमानाव्यतिरिक्त इतर अनेक घटकांवर अवलंबून असते या वस्तुस्थितीमुळे. याव्यतिरिक्त, बहुतेक फ्लोरोसेंट प्रोब उच्च तापमानात अस्थिर असतात. म्हणून, QPM आणि विशेषतः CGM ऑप्टिकल मायक्रोस्कोपी वापरून उच्च तापमानावरील जीवनाचा अभ्यास करण्यासाठी एक आदर्श तापमान मायक्रोस्कोपी तंत्राचे प्रतिनिधित्व करते.
S. shibatae चा अभ्यास, जे 80°C वर चांगल्या प्रकारे जगतात, असे दर्शविते की LA-HTM केवळ साध्या थर्मोफाइल्सच नव्हे तर हायपरथर्मोफाइल्सचा अभ्यास करण्यासाठी लागू केले जाऊ शकते. तत्वतः, LA-HTM वापरून पोहोचता येण्याजोग्या तापमानाच्या श्रेणीला मर्यादा नाही आणि 100°C पेक्षा जास्त तापमान देखील उकळल्याशिवाय वातावरणाच्या दाबावर पोहोचू शकते, जसे की आमच्या 38 च्या गटाने वातावरणातील हायड्रोथर्मल केमिस्ट्री ऍप्लिकेशन्समध्ये दाखवले आहे. दाब A. सोन्याचे नॅनोकण 40 तशाच प्रकारे गरम करण्यासाठी लेसरचा वापर केला जातो. अशाप्रकारे, एलए-एचटीएममध्ये मानक परिस्थितीत (म्हणजे पर्यावरणीय तणावाखाली) मानक उच्च रिझोल्यूशन ऑप्टिकल मायक्रोस्कोपीसह अभूतपूर्व हायपरथर्मोफाइल्सचे निरीक्षण करण्यासाठी वापरण्याची क्षमता आहे.
सर्व प्रयोग होममेड मायक्रोस्कोप वापरून केले गेले, ज्यात कोहलर प्रदीपन (LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW सह), मॅन्युअल xy हालचालीसह नमुना धारक, उद्दिष्टे (Olympus, 60x, 0.7 NA, air, LUCPlanFLN60X, O12ilx, O15x. , UPLFLN60XOI), CGM कॅमेरा (QLSI क्रॉस ग्रेटिंग, 39 µm पिच, Andor Zyla कॅमेरा सेन्सरपासून 0.87 mm) तीव्रता आणि वेव्हफ्रंट इमेजिंग प्रदान करण्यासाठी आणि sCMOS कॅमेरा (ORCA Flash 4.0 V3, 16-बिट मोड , हमामात्सु वरून रेकॉर्ड करण्यासाठी) आकृती 5 मध्ये दर्शविलेले डेटा (बॅक्टेरियल पोहणे). डायक्रोइक बीम स्प्लिटर 749 एनएम ब्राइटलाइन एज (सेमरॉक, FF749-SDi01) आहे. कॅमेऱ्याच्या समोरील फिल्टर हा 694 शॉर्ट पास फिल्टर (FF02-694/SP-25, Semrock) आहे. टायटॅनियम सॅफायर लेसर (लेझर वर्डी जी10, 532 एनएम, 10 डब्ल्यू, पंपेड त्सुनामी लेसर पोकळी, अंजीर 2-5 मध्ये स्पेक्ट्रा-फिजिक्स, पुढे मिलेनिया लेसरने बदलले, स्पेक्ट्राफिजिक्स 10 डब्ल्यू, पंप केलेले मीरा लेसर पोकळी, एफ.2 कोहेरंट -5). 6 आणि 7) हे तरंगलांबी \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm वर सेट केले आहे, जे सोन्याच्या नॅनोकणांच्या प्लाझमोन रेझोनान्स स्पेक्ट्रमशी संबंधित आहे. अवकाशीय प्रकाश मॉड्युलेटर (1920 × 1152 पिक्सेल) मीडोलार्क ऑप्टिक्स कडून खरेदी केले गेले होते.
क्रॉस ग्रेटिंग वेव्हफ्रंट मायक्रोस्कोपी (CGM) हे एक ऑप्टिकल मायक्रोस्कोपी तंत्र आहे जे पारंपारिक कॅमेऱ्याच्या सेन्सरपासून एक मिलिमीटर अंतरावर द्विमितीय डिफ्रॅक्शन ग्रेटिंग (याला क्रॉस ग्रेटिंग देखील म्हणतात) एकत्र करते. आम्ही या अभ्यासात वापरलेले CGM चे सर्वात सामान्य उदाहरण म्हणजे चार-तरंगलांबी ट्रान्सव्हर्स शिफ्ट इंटरफेरोमीटर (QLSI), जेथे क्रॉस-ग्रेटिंगमध्ये प्रिमॉट एट अल द्वारे सादर केलेला आणि पेटंट केलेला तीव्रता/फेज चेकरबोर्ड नमुना असतो. 200034 मध्ये. उभ्या आणि क्षैतिज जाळीच्या रेषा सेन्सरवर ग्रिडसारख्या सावल्या तयार करतात, ज्यातील विकृती घटना प्रकाशाचे ऑप्टिकल वेव्हफ्रंट विरूपण (किंवा समतुल्य फेज प्रोफाइल) प्राप्त करण्यासाठी रिअल टाइममध्ये संख्यात्मकरित्या प्रक्रिया केली जाऊ शकते. मायक्रोस्कोपवर वापरल्यावर, CGM कॅमेरा नॅनोमीटर ३६ च्या क्रमाने संवेदनशीलतेसह, इमेज केलेल्या ऑब्जेक्टचा ऑप्टिकल मार्ग फरक प्रदर्शित करू शकतो, ज्याला ऑप्टिकल डेप्थ (OT) देखील म्हणतात. कोणत्याही CGM मापनामध्ये, ऑप्टिकल घटक किंवा बीममधील कोणतेही दोष दूर करण्यासाठी, प्राथमिक संदर्भ OT प्रतिमा घेतली पाहिजे आणि त्यानंतरच्या कोणत्याही प्रतिमांमधून वजा करणे आवश्यक आहे.
संदर्भामध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे CGM कॅमेरा वापरून तापमान मायक्रोस्कोपी केली गेली. 32. थोडक्यात, द्रव गरम केल्याने त्याचा अपवर्तक निर्देशांक बदलतो, ज्यामुळे एक थर्मल लेन्स प्रभाव तयार होतो ज्यामुळे घटना बीम विकृत होतो. हे वेव्हफ्रंट विरूपण CGM द्वारे मोजले जाते आणि द्रव माध्यमात त्रि-आयामी तापमान वितरण प्राप्त करण्यासाठी डीकॉनव्होल्यूशन अल्गोरिदम वापरून प्रक्रिया केली जाते. जर सोन्याचे नॅनो कण संपूर्ण नमुन्यात समान रीतीने वितरीत केले गेले, तर चांगल्या प्रतिमा तयार करण्यासाठी तापमान मॅपिंग जीवाणू-मुक्त भागात केले जाऊ शकते, जे आपण कधीकधी करतो. संदर्भ CGM प्रतिमा गरम न करता (लेसर बंद असताना) मिळवली गेली आणि नंतर लेसर चालू असलेल्या प्रतिमेतील त्याच ठिकाणी कॅप्चर केली गेली.
तापमान इमेजिंगसाठी वापरल्या जाणाऱ्या समान CGM कॅमेरा वापरून कोरड्या वस्तुमानाचे मापन केले जाते. CGM संदर्भ प्रतिमा एक्सपोजर दरम्यान x आणि y मध्ये द्रुतगतीने हलवून OT मध्ये जीवाणूंच्या उपस्थितीमुळे कोणत्याही विसंगतीची सरासरी काढण्याचे साधन म्हणून प्राप्त केली गेली. जीवाणूंच्या OT प्रतिमांमधून, रेफमध्ये वर्णन केलेल्या प्रक्रियेचे अनुसरण करून मॅटलॅबच्या होममेड सेगमेंटेशन अल्गोरिदम (उपविभाग "संख्यात्मक कोड" पहा) वापरून निवडलेल्या क्षेत्रांवर प्रतिमांचा समूह वापरून त्यांचे बायोमास प्राप्त केले गेले. ४८. थोडक्यात, आम्ही संबंध वापरतो \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}y\), जेथे \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) ही ऑप्टिकल खोलीची प्रतिमा आहे, \(m\) आहे कोरडे वजन आणि \({{{{\rm{\alpha }}}}}\) एक स्थिरांक आहे. आम्ही \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg निवडले, जे जिवंत पेशींसाठी एक विशिष्ट स्थिरांक आहे.
25 मिमी व्यासाची आणि सोन्याच्या नॅनोपार्टिकल्सने लेपित 150 µm जाडीची कव्हर स्लिप ॲटोफ्लुओरटीएम चेंबरमध्ये (थर्मोफिशर) सोन्याचे नॅनोपार्टिकल्स समोरासमोर ठेवली होती. जिओबॅसिलस स्टीरोथर्मोफिलस प्रत्येक दिवसाच्या प्रयोगापूर्वी LB माध्यमात (200 rpm, 60°C) रात्रभर प्रीकल्चर केले गेले. 0.3 ते 0.5 ऑप्टिकल घनता (OD) असलेल्या G. स्टीरोथर्मोफिलसच्या निलंबनाचा 5 μl एक थेंब सोन्याच्या नॅनोकणांसह कव्हर स्लिपवर ठेवण्यात आला होता. त्यानंतर, मध्यभागी 5 मिमी व्यासाच्या छिद्रासह 18 मिमी व्यासाची एक गोल कव्हर स्लिप ड्रॉपवर टाकली गेली आणि त्याच ऑप्टिकल घनतेसह 5 μl बॅक्टेरियल सस्पेंशन छिद्राच्या मध्यभागी वारंवार लागू केले गेले. कव्हरस्लिप्सवरील विहिरी संदर्भामध्ये वर्णन केलेल्या प्रक्रियेनुसार तयार केल्या होत्या. 45 (अधिक माहितीसाठी पूरक माहिती पहा). नंतर द्रव थर कोरडे होण्यापासून रोखण्यासाठी कव्हरस्लिपमध्ये 1 मिली एलबी माध्यम घाला. इनक्युबेशन दरम्यान माध्यमाचे बाष्पीभवन टाळण्यासाठी शेवटची कव्हरस्लिप Attofluor™ चेंबरच्या बंद झाकणावर ठेवली जाते. उगवण प्रयोगांसाठी, आम्ही बीजाणू वापरले, जे पारंपारिक प्रयोगांनंतर, कधीकधी वरच्या कव्हरस्लिपला झाकतात. सल्फोलोबस शिबाटे मिळविण्यासाठी अशीच पद्धत वापरली गेली. तीन दिवस (200 rpm, 75°C) थिओबॅसिलस सेराटाची प्राथमिक लागवड मध्यम 182 (DSMZ) मध्ये करण्यात आली.
मायसेलर ब्लॉक कॉपॉलिमर लिथोग्राफीद्वारे सोन्याच्या नॅनोकणांचे नमुने तयार केले गेले. या प्रक्रियेचे तपशील चॅपमध्ये वर्णन केले आहे. 60. थोडक्यात, टोल्यूनिमध्ये HAuCl4 सह कॉपॉलिमर मिसळून सोन्याचे आयन एन्कॅप्स्युलेट करणारे मायसेल्स संश्लेषित केले गेले. नंतर स्वच्छ केलेल्या कव्हरस्लिप्स सोल्युशनमध्ये बुडवल्या गेल्या आणि सोन्याच्या बिया मिळविण्यासाठी कमी करणाऱ्या एजंटच्या उपस्थितीत अतिनील विकिरणाने उपचार केले गेले. शेवटी, KAuCl4 आणि इथेनॉलमाइनच्या जलीय द्रावणासह 16 मिनिटांसाठी कव्हरस्लिपशी संपर्क साधून सोन्याच्या बिया उगवल्या गेल्या, ज्यामुळे जवळच्या इन्फ्रारेडमध्ये नॉन-गोलाकार सोन्याच्या नॅनोकणांची अर्ध-नियतकालिक आणि अतिशय एकसमान व्यवस्था निर्माण झाली.
इंटरफेरोग्राम OT प्रतिमांमध्ये रूपांतरित करण्यासाठी, आम्ही दुव्यामध्ये तपशीलवार दिलेल्या होममेड अल्गोरिदमचा वापर केला. 33 आणि खालील सार्वजनिक भांडारात Matlab पॅकेज म्हणून उपलब्ध आहे: https://github.com/baffou/CGMprocess. पॅकेज रेकॉर्ड केलेल्या इंटरफेरोग्राम (संदर्भ प्रतिमांसह) आणि कॅमेरा ॲरे अंतरावर आधारित तीव्रता आणि OT प्रतिमांची गणना करू शकते.
दिलेले तापमान प्रोफाइल प्राप्त करण्यासाठी SLM वर लागू केलेल्या फेज पॅटर्नची गणना करण्यासाठी, आम्ही पूर्वी विकसित केलेला होममेड अल्गोरिदम 39,42 वापरला जो खालील सार्वजनिक भांडारात उपलब्ध आहे: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. इनपुट हे इच्छित तापमान फील्ड आहे, जे डिजिटली किंवा मोनोक्रोम bmp प्रतिमेद्वारे सेट केले जाऊ शकते.
पेशींचे विभाजन करण्यासाठी आणि त्यांचे कोरडे वजन मोजण्यासाठी, आम्ही खालील सार्वजनिक भांडारात प्रकाशित आमचा Matlab अल्गोरिदम वापरला: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. प्रत्येक प्रतिमेवर, वापरकर्त्याने स्वारस्य असलेल्या बॅक्टेरिया किंवा mCFU वर क्लिक करणे आवश्यक आहे, कांडीची संवेदनशीलता समायोजित करणे आणि निवडीची पुष्टी करणे आवश्यक आहे.
अभ्यासाच्या रचनेबद्दल अधिक माहितीसाठी, या लेखाशी जोडलेला निसर्ग संशोधन अहवाल गोषवारा पहा.
या अभ्यासाच्या परिणामांना समर्थन देणारा डेटा संबंधित लेखकांकडून वाजवी विनंतीवर उपलब्ध आहे.
या अभ्यासात वापरलेला स्त्रोत कोड पद्धती विभागामध्ये तपशीलवार आहे आणि डीबग आवृत्त्या https://github.com/baffou/ वरून खालील रिपॉझिटरीजमध्ये डाउनलोड केल्या जाऊ शकतात: SLM_temperatureShaping, CGMprocess आणि CGM_magicWandSegmentation.
मेहता, आर., सिंघल, पी., सिंग, एच., दामले, डी. आणि शर्मा, एके इनसाइट इन थर्मोफाइल्स आणि त्यांचे विस्तृत-स्पेक्ट्रम अनुप्रयोग. मेहता, आर., सिंघल, पी., सिंग, एच., दामले, डी. आणि शर्मा, एके इनसाइट इन थर्मोफाइल्स आणि त्यांचे विस्तृत-स्पेक्ट्रम अनुप्रयोग.मेहता, आर., सिंघल, पी., सिंग, एच., दामले, डी. आणि शर्मा, एके थर्मोफाइल्सचे विहंगावलोकन आणि त्यांचे विस्तृत अनुप्रयोग. मेहता, आर., सिंघल, पी., सिंग, एच., दामले, डी. आणि शर्मा, एके 深入了解嗜热菌及其广谱应用. मेहता, आर., सिंघल, पी. सिंग, एच., दामले, डी. आणि शर्मा, ए.के.मेहता आर., सिंघल पी., सिंग एच., दामले डी. आणि शर्मा एके थर्मोफाइल्सची सखोल माहिती आणि अनुप्रयोगांची विस्तृत श्रेणी.3 जैवतंत्रज्ञान 6, 81 (2016).