सर्वसमावेशक प्रोटिओमिक्स लक्षणे नसलेल्या आणि लक्षणे नसलेल्या अल्झायमर रोगामध्ये मेंदू-आधारित सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड बायोमार्कर प्रकट करतात

अल्झायमर रोग (AD) मध्ये प्रथिने बायोमार्कर नसतात जे त्याचे अनेक अंतर्निहित पॅथोफिजियोलॉजी प्रतिबिंबित करतात, निदान आणि उपचारांच्या प्रगतीमध्ये अडथळा आणतात. येथे, एडी पॅथोफिजियोलॉजीच्या विस्तृत श्रेणीचे प्रतिनिधित्व करणारे सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) बायोमार्कर ओळखण्यासाठी आम्ही सर्वसमावेशक प्रोटिओमिक्स वापरतो. मल्टीप्लेक्स मास स्पेक्ट्रोमेट्रीने AD CSF आणि मेंदूमध्ये अनुक्रमे 3,500 आणि अंदाजे 12,000 प्रथिने ओळखली. मेंदूच्या प्रोटीओमच्या नेटवर्क विश्लेषणाने 44 जैवविविधता मॉड्यूल्सचे निराकरण केले, त्यापैकी 15 सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड प्रोटीओमसह आच्छादित आहेत. या ओव्हरलॅपिंग मॉड्यूल्समधील CSF AD मार्कर वेगवेगळ्या पॅथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियांचे प्रतिनिधित्व करणारे पाच प्रोटीन गटांमध्ये दुमडलेले आहेत. एडी मेंदूतील सिनॅप्स आणि मेटाबोलाइट्स कमी होतात, परंतु सीएसएफ वाढते, तर मेंदू आणि सीएसएफमधील ग्लियाल समृद्ध मायलिनेशन आणि रोगप्रतिकारक गट वाढतात. 500 पेक्षा जास्त अतिरिक्त CSF नमुन्यांमध्ये पॅनेल बदलांची सातत्य आणि रोग विशिष्टता पुष्टी केली गेली. या गटांनी लक्षणे नसलेल्या एडीमध्ये जैविक उपसमूह देखील ओळखले. एकूणच, हे परिणाम AD मध्ये क्लिनिकल ऍप्लिकेशन्ससाठी वेब-आधारित बायोमार्कर टूल्सच्या दिशेने एक आशादायक पाऊल आहेत.
अल्झायमर रोग (AD) हे न्यूरोडिजेनेरेटिव्ह डिमेंशियाचे जगभरातील सर्वात सामान्य कारण आहे आणि सिनॅप्टिक ट्रान्समिशन, ग्लियाल-मध्यस्थ प्रतिकारशक्ती आणि माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय (1-3) यासह जैविक प्रणालीतील बिघडलेल्या कार्यांच्या विस्तृत श्रेणीद्वारे वैशिष्ट्यीकृत आहे. तथापि, त्याचे प्रस्थापित प्रोटीन बायोमार्कर अजूनही अमायलोइड आणि टाऊ प्रथिने शोधण्यावर लक्ष केंद्रित करतात आणि त्यामुळे या वैविध्यपूर्ण पॅथोफिजियोलॉजीचे प्रतिबिंबित करू शकत नाहीत. सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) मध्ये सर्वात विश्वासार्हपणे मोजले जाणारे हे "कोर" प्रोटीन बायोमार्कर्स (i) amyloid beta peptide 1-42 (Aβ1-42), जे कॉर्टिकल अमायलोइड प्लेक्सची निर्मिती प्रतिबिंबित करतात; (ii) एकूण ताऊ, अक्षताच्या ऱ्हासाचे लक्षण; (iii) phospho-tau (p-tau), पॅथॉलॉजिकल टाऊ हायपरफॉस्फोरिलेशनचा प्रतिनिधी (4-7). जरी या सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड बायोमार्कर्सने आम्हाला "चिन्हांकित" AD प्रथिने रोग (4-7) शोधण्यात मोठ्या प्रमाणात सोय केली असली तरी, ते रोगामागील जटिल जीवशास्त्राचा फक्त एक छोटासा भाग दर्शवतात.
AD बायोमार्कर्सच्या पॅथोफिजियोलॉजिकल विविधतेच्या कमतरतेमुळे अनेक आव्हाने उभी राहिली आहेत, ज्यात (i) एडी रूग्णांची जैविक विषमता ओळखण्यात आणि त्याचे प्रमाण निश्चित करण्यात असमर्थता, (ii) रोगाची तीव्रता आणि प्रगतीचे अपुरे मापन, विशेषत: प्रीक्लिनिकल स्टेजमध्ये, आणि ( iii) उपचारात्मक औषधांचा विकास जो न्यूरोलॉजिकल बिघाडाच्या सर्व पैलूंचे पूर्णपणे निराकरण करण्यात अयशस्वी ठरला. संबंधित रोगांपासून AD चे वर्णन करण्यासाठी ऐतिहासिक पॅथॉलॉजीवर आमचा अवलंबन केवळ या समस्यांना वाढवते. अधिकाधिक पुरावे दर्शवितात की स्मृतिभ्रंश असलेल्या बहुतेक वृद्ध लोकांमध्ये संज्ञानात्मक घट (8) एकापेक्षा जास्त पॅथॉलॉजिकल वैशिष्ट्ये आहेत. AD पॅथॉलॉजी असलेल्या 90% किंवा त्याहून अधिक व्यक्तींना रक्तवहिन्यासंबंधी रोग, TDP-43 समावेश किंवा इतर क्षीण रोग (9) असतात. पॅथॉलॉजिकल ओव्हरलॅपच्या या उच्च प्रमाणांमुळे स्मृतिभ्रंशासाठी आमच्या सध्याच्या निदान फ्रेमवर्कमध्ये व्यत्यय आला आहे आणि रोगाची अधिक व्यापक पॅथोफिजियोलॉजिकल व्याख्या आवश्यक आहे.
विविध प्रकारच्या AD बायोमार्कर्सची तातडीची गरज लक्षात घेता, बायोमार्कर्स शोधण्यासाठी फील्ड संपूर्ण प्रणालीवर आधारित "ओमिक्स" पद्धतीचा अवलंब करत आहे. एक्सीलरेटेड फार्मास्युटिकल पार्टनरशिप (AMP)-AD अलायन्स 2014 मध्ये लाँच करण्यात आले आणि कार्यक्रमात आघाडीवर आहे. नॅशनल इन्स्टिट्यूट ऑफ हेल्थ, अकादमी आणि उद्योग यांच्या या बहुविद्याशाखीय प्रयत्नाचे उद्दिष्ट एडी च्या पॅथोफिजियोलॉजीची अधिक चांगल्या प्रकारे व्याख्या करण्यासाठी आणि जैवविविधता निदान विश्लेषण आणि उपचार धोरणे विकसित करण्यासाठी सिस्टम-आधारित धोरणे वापरणे आहे (10). या प्रकल्पाचा एक भाग म्हणून, नेटवर्क प्रोटिओमिक्स हे एडी मध्ये सिस्टम-आधारित बायोमार्कर्सच्या प्रगतीसाठी एक आशादायक साधन बनले आहे. हा निःपक्षपाती डेटा-चालित दृष्टीकोन जटिल प्रोटिओमिक्स डेटा सेटचे समूह किंवा "मॉड्यूल" सह-अभिव्यक्त प्रथिनांमध्ये आयोजित करतो जे विशिष्ट पेशी प्रकार, ऑर्गेनेल्स आणि जैविक कार्यांशी संबंधित आहेत (11-13). एडी मेंदूवर (13-23) जवळपास 12 माहिती-समृद्ध नेटवर्क प्रोटीओमिक्स अभ्यास आयोजित केले गेले आहेत. एकूणच, हे विश्लेषण सूचित करतात की एडी ब्रेन नेटवर्क प्रोटीओम स्वतंत्र समूह आणि एकाधिक कॉर्टिकल क्षेत्रांमध्ये उच्च संरक्षित मॉड्यूलर संस्था राखते. याव्यतिरिक्त, यापैकी काही मॉड्यूल डेटा संचांमध्ये AD-संबंधित विपुलतेमध्ये पुनरुत्पादक बदल दर्शवितात, अनेक रोगांचे पॅथोफिजियोलॉजी प्रतिबिंबित करतात. एकत्रितपणे, हे निष्कर्ष एडी मध्ये सिस्टम-आधारित बायोमार्कर म्हणून मेंदू नेटवर्क प्रोटीओमच्या शोधासाठी एक आशादायक अँकर पॉइंट प्रदर्शित करतात.
एडी ब्रेन नेटवर्क प्रोटीओमचे वैद्यकीयदृष्ट्या उपयुक्त सिस्टीम-आधारित बायोमार्करमध्ये रूपांतर करण्यासाठी, आम्ही एडी सीएसएफच्या प्रोटीओमिक विश्लेषणासह मेंदू-व्युत्पन्न नेटवर्क एकत्र केले. या एकात्मिक पध्दतीमुळे CSF बायोमार्कर्सचे पाच आशाजनक संच ओळखले गेले जे मेंदू-आधारित पॅथोफिजियोलॉजीच्या विस्तृत श्रेणीशी संबंधित आहेत, ज्यात सिनॅप्सेस, रक्तवाहिन्या, मायलिनेशन, जळजळ आणि चयापचय मार्गांचे बिघडलेले कार्य यांचा समावेश आहे. आम्ही या बायोमार्कर पॅनेलचे विविध न्यूरोडिजेनेरेटिव्ह रोगांमधील 500 पेक्षा जास्त CSF नमुन्यांसह अनेक प्रतिकृती विश्लेषणाद्वारे यशस्वीरित्या प्रमाणीकरण केले. या प्रमाणीकरण विश्लेषणांमध्ये लक्षणे नसलेल्या AD (AsymAD) असलेल्या रूग्णांच्या CSF मधील गट लक्ष्यांचे परीक्षण करणे किंवा सामान्य संज्ञानात्मक वातावरणात असामान्य अमायलोइड जमा झाल्याचा पुरावा दर्शविणे समाविष्ट आहे. ही विश्लेषणे AsymAD लोकसंख्येतील महत्त्वपूर्ण जैविक विषमता हायलाइट करतात आणि पॅनेल मार्कर ओळखतात जे रोगाच्या सुरुवातीच्या टप्प्यात व्यक्तींना उपप्रकार करू शकतात. एकूणच, हे परिणाम बहुविध प्रणालींवर आधारित प्रोटीन बायोमार्कर टूल्सच्या विकासातील एक महत्त्वाची पायरी दर्शवतात जे AD ला भेडसावणाऱ्या अनेक क्लिनिकल आव्हानांचे यशस्वीपणे निराकरण करू शकतात.
या अभ्यासाचा मुख्य उद्देश नवीन सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड बायोमार्कर्स ओळखणे आहे जे विविध मेंदू-आधारित पॅथोफिजियोलॉजी प्रतिबिंबित करतात ज्यामुळे एडी. आकृती S1 आमच्या संशोधन पद्धतीची रूपरेषा देते, ज्यामध्ये (i) AD CSF च्या प्राथमिक निष्कर्षांद्वारे चालवलेले सर्वसमावेशक विश्लेषण आणि एकाधिक मेंदू-संबंधित CSF रोग बायोमार्कर ओळखण्यासाठी नेटवर्क ब्रेन प्रोटीओम, आणि (ii) त्यानंतरची प्रतिकृती हे बायोमार्कर्स अनेक स्वतंत्र सेरेब्रोस्पाइनलमध्ये आहेत. द्रव समूह. एमोरी गोइझुएटा अल्झायमर डिसीज रिसर्च सेंटर (ADRC) मधील 20 संज्ञानात्मक सामान्य व्यक्ती आणि 20 एडी रूग्णांमध्ये CSF च्या भिन्न अभिव्यक्तीच्या विश्लेषणासह शोध-आधारित संशोधन सुरू झाले. AD चे निदान हे सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये कमी Aβ1-42 आणि एकूण tau आणि p-tau च्या उच्च पातळीच्या उपस्थितीत लक्षणीय संज्ञानात्मक कमजोरी म्हणून परिभाषित केले आहे [मीन मॉन्ट्रियल कॉग्निटिव्ह असेसमेंट (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (टेबल S1A). नियंत्रण (म्हणजे MoCA, 26.7 ± 2.2) मध्ये CSF बायोमार्कर्सची सामान्य पातळी होती.
मानवी CSF प्रथिनांच्या विपुलतेच्या गतिशील श्रेणीद्वारे वैशिष्ट्यीकृत आहे, ज्यामध्ये अल्ब्युमिन आणि इतर अत्यंत मुबलक प्रथिने स्वारस्य असलेल्या प्रथिनांचा शोध टाळू शकतात (24). प्रथिने शोधाची खोली वाढवण्यासाठी, आम्ही मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) विश्लेषणापूर्वी (24) प्रत्येक CSF नमुन्यातून प्रथम 14 अत्यंत मुबलक प्रथिने काढून टाकली. एमएस द्वारे एकूण 39,805 पेप्टाइड्स ओळखले गेले, जे 40 नमुन्यांमध्ये 3691 प्रोटीओम्समध्ये मॅप केले गेले. प्रथिनांचे प्रमाणीकरण मल्टिपल टँडम मास टॅग (TMT) लेबलिंग (18, 25) द्वारे केले जाते. गहाळ डेटाचे निराकरण करण्यासाठी, आम्ही त्यानंतरच्या विश्लेषणात कमीतकमी 50% नमुन्यांमध्ये केवळ तेच प्रथिने समाविष्ट केले, अशा प्रकारे शेवटी 2875 प्रोटीओमचे प्रमाण निश्चित केले. एकूण प्रथिने विपुलतेच्या पातळीतील महत्त्वपूर्ण फरकामुळे, एक नियंत्रण नमुना सांख्यिकीयदृष्ट्या एक आउटलायर (13) मानला गेला आणि त्यानंतरच्या विश्लेषणामध्ये समाविष्ट केला गेला नाही. उर्वरित 39 नमुन्यांची विपुलता मूल्ये वय, लिंग आणि बॅच सहप्रवाह (13-15, 17, 18, 20, 26) नुसार समायोजित केली गेली.
रीग्रेशन डेटा सेटवरील विभेदक अभिव्यक्तीचे मूल्यमापन करण्यासाठी सांख्यिकीय टी-चाचणी विश्लेषणाचा वापर करून, या विश्लेषणाने प्रथिने ओळखले ज्यांची विपुलता पातळी लक्षणीयरीत्या बदलली होती (P <0.05) नियंत्रण आणि AD प्रकरणे (टेबल S2A). आकृती 1A मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, AD मध्ये एकूण 225 प्रथिनांची विपुलता लक्षणीयरीत्या कमी झाली आणि 303 प्रथिनांची विपुलता लक्षणीयरीत्या वाढली. या भिन्नपणे व्यक्त केलेल्या प्रथिनांमध्ये पूर्वी ओळखल्या गेलेल्या सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड एडी मार्करचा समावेश होतो, जसे की मायक्रोट्यूब्यूल-संबंधित प्रोटीन टाऊ (MAPT; P = 3.52 × 10−8), न्यूरोफिलामेंट (NEFL; P = 6.56 × 10−3), वाढ-संबंधित प्रथिने 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), फॅटी ऍसिड बाइंडिंग प्रोटीन 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 सारखे 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), न्यूरल ग्रॅन्युलिन (NRGN; P = 3.43 × 10−4) आणि VGF मज्जातंतू वाढ घटक (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). तथापि, आम्ही GDP पृथक्करण अवरोधक 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) आणि SPARC-संबंधित मॉड्युलर कॅल्शियम बाइंडिंग 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) सारखी इतर महत्त्वाची लक्ष्ये देखील ओळखली. 225 लक्षणीयरीत्या कमी झालेल्या प्रथिनांच्या जीन ऑन्टोलॉजी (GO) विश्लेषणाने स्टिरॉइड चयापचय, रक्त गोठणे आणि संप्रेरक क्रियाकलाप (आकृती 1B आणि टेबल S2B) यांसारख्या शरीरातील द्रव प्रक्रियांशी घनिष्ठ संबंध असल्याचे दिसून आले. याउलट, 303 ची लक्षणीय वाढलेली प्रथिने सेल संरचना आणि ऊर्जा चयापचय यांच्याशी जवळून संबंधित आहे.
(A) ज्वालामुखी प्लॉट टी-चाचणीद्वारे प्राप्त झालेल्या -log10 सांख्यिकीय P मूल्य (y-अक्ष) च्या सापेक्ष log2 पट बदल (x-axis) दर्शवितो, ज्याचा उपयोग नियंत्रण (CT) आणि मधील विभेदक अभिव्यक्ती शोधण्यासाठी केला जातो. सर्व प्रथिनांपैकी सीएसएफ प्रोटीओमची एडी प्रकरणे. AD मध्ये लक्षणीय प्रमाणात कमी झालेली प्रथिने (P <0.05) निळ्या रंगात दर्शविली आहेत, तर रोगामध्ये लक्षणीय वाढलेली प्रथिने लाल रंगात दर्शविली आहेत. निवडलेल्या प्रोटीनला लेबल लावले जाते. (ब) प्रथिनांशी संबंधित शीर्ष GO संज्ञा AD मध्ये लक्षणीयरीत्या कमी (निळ्या) आणि वाढलेल्या (लाल) आहेत. जैविक प्रक्रिया, आण्विक कार्ये आणि सेल्युलर घटकांच्या क्षेत्रात सर्वाधिक z-स्कोअर असलेल्या तीन GO संज्ञा दर्शविते. (C) MS ने CSF नमुन्यात (डावीकडे) MAPT पातळी मोजली आणि नमुना ELISA tau पातळीशी (उजवीकडे) त्याचा सहसंबंध. संबंधित P मूल्यासह Pearson सहसंबंध गुणांक प्रदर्शित केला जातो. एका एडी केससाठी एलिसा डेटाच्या कमतरतेमुळे, या आकडेवारीमध्ये विश्लेषण केलेल्या 39 पैकी 38 प्रकरणांची मूल्ये समाविष्ट आहेत. (D) पर्यवेक्षित क्लस्टर विश्लेषण (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) समायोजित P <0.01) नियंत्रणावर आणि AD CSF ने डेटा सेटमधील 65 सर्वात लक्षणीय बदललेले प्रथिने वापरून नमुने शोधले. मानकीकरण, सामान्यीकरण.
MAPT ची प्रोटीओमिक पातळी स्वतंत्रपणे मोजलेल्या ELISA tau पातळीशी जवळून संबंधित आहे (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; आकृती 1C), आमच्या MS मापनाच्या वैधतेचे समर्थन करते. एमायलोइड प्रिकर्सर प्रोटीन (एपीपी) च्या स्तरावर ट्रायप्सिन पचन झाल्यानंतर, Aβ1-40 आणि Aβ1-42 च्या C-टर्मिनसमध्ये मॅप केलेले आइसोफॉर्म-विशिष्ट पेप्टाइड्स कार्यक्षमतेने आयनीकरण केले जाऊ शकत नाहीत (27, 28). म्हणून, आम्ही ओळखलेल्या APP पेप्टाइड्सचा ELISA Aβ1-42 स्तरांशी काहीही संबंध नाही. प्रत्येक केसच्या विभेदक अभिव्यक्तीचे मूल्यमापन करण्यासाठी, आम्ही नमुन्यांचे (टेबल S2A) पर्यवेक्षित क्लस्टर विश्लेषण करण्यासाठी P <0.0001 [खोटे शोध दर (FDR) दुरुस्त P <0.01] सह भिन्न व्यक्त प्रथिने वापरली. आकृती 1D मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, ही 65 अत्यंत महत्त्वाची प्रथिने रोगाच्या स्थितीनुसार नमुने योग्यरित्या क्लस्टर करू शकतात, नियंत्रणासारख्या वैशिष्ट्यांसह एक एडी केस वगळता. या 65 प्रथिनेंपैकी 63 AD मध्ये वाढले, तर फक्त दोन (CD74 आणि ISLR) कमी झाले. एकूण, या सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड विश्लेषणांनी एडी मधील शेकडो प्रथिने ओळखली आहेत जी रोग बायोमार्कर म्हणून काम करू शकतात.
मग आम्ही एडी ब्रेन प्रोटीओमचे स्वतंत्र नेटवर्क विश्लेषण केले. या शोधाच्या मेंदूच्या समूहामध्ये नियंत्रण (n = 10), पार्किन्सन्स रोग (PD; n = 10), मिश्रित AD/PD (n = 10) आणि AD (n = 10) प्रकरणांचा समावेश होतो. ) नमुना. Emery Goizueta ADRC. या 40 प्रकरणांचे लोकसंख्याशास्त्र पूर्वी वर्णन केले गेले आहे (25) आणि सारणी S1B मध्ये सारांशित केले आहे. या 40 मेंदूच्या ऊतींचे आणि 27 प्रकरणांच्या प्रतिकृती समूहाचे विश्लेषण करण्यासाठी आम्ही TMT-MS चा वापर केला. एकूण, या दोन मेंदू डेटा संचांनी 227,121 अद्वितीय पेप्टाइड्स तयार केले, जे 12,943 प्रोटीओम (25) वर मॅप केले गेले. त्यानंतरच्या तपासणीत किमान 50% प्रकरणांमध्ये केवळ त्या प्रथिनांचा समावेश करण्यात आला. अंतिम शोध डेटा सेटमध्ये 8817 मात्रा निर्धारित प्रथिने आहेत. वय, लिंग आणि पोस्ट-मॉर्टम इंटरव्हल (PMI) यावर आधारित प्रथिने विपुलता पातळी समायोजित करा. रीग्रेशन नंतर सेट केलेल्या डेटाच्या विभेदक अभिव्यक्ती विश्लेषणात असे दिसून आले की >2000 प्रथिने पातळी दोन किंवा अधिक रोग समूहांमध्ये लक्षणीयरीत्या बदलली गेली [P <0.05, भिन्नता विश्लेषण (ANOVA)]. त्यानंतर, आम्ही विभेदित प्रथिने आणि P <0.0001 AD/कंट्रोल आणि/किंवा AD/PD तुलना (आकृती S2, A आणि B, टेबल S2C) वर आधारित पर्यवेक्षित क्लस्टर विश्लेषण केले. हे 165 अत्यंत बदललेले प्रथिने नियंत्रण आणि PD नमुन्यांमधून AD पॅथॉलॉजीची प्रकरणे स्पष्टपणे दर्शवतात, संपूर्ण प्रोटीओममधील मजबूत AD-विशिष्ट बदलांची पुष्टी करतात.
त्यानंतर आम्ही शोधलेल्या ब्रेन प्रोटीओमवर नेटवर्क विश्लेषण करण्यासाठी वेटेड जीन को-एक्स्प्रेशन नेटवर्क ॲनालिसिस (WGCNA) नावाचा अल्गोरिदम वापरला, जे समान अभिव्यक्ती नमुने (11-13) सह प्रथिन मॉड्यूल्समध्ये डेटा सेट करते. विश्लेषणाने सर्वात मोठ्या (M1, n = 1821 प्रथिने) पासून सर्वात लहान (M44, n = 34 प्रथिने) (आकृती 2A आणि तक्ता S2D) पर्यंत 44 मॉड्यूल्स (M) सह-अभिव्यक्त प्रथिने ओळखले. वर नमूद केल्याप्रमाणे (13) प्रत्येक मॉड्यूलच्या प्रातिनिधिक अभिव्यक्ती प्रोफाइल किंवा वैशिष्ट्यपूर्ण प्रथिनांची गणना करा, आणि रोग स्थिती आणि एडी पॅथॉलॉजीशी संबंधित करा, म्हणजेच अल्झायमर रोग नोंदणी (सीईआरएडी) आणि ब्रॅक स्कोअर (आकृती 2B) ची युती स्थापित करा. एकूणच, एडी न्यूरोपॅथॉलॉजी (पी <0.05) शी 17 मॉड्यूल्स लक्षणीयरीत्या संबंधित होते. यापैकी अनेक रोग-संबंधित मॉड्यूल्स देखील सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करने समृद्ध आहेत (आकृती 2B). वर नमूद केल्याप्रमाणे (13), सेल प्रकार संवर्धन हे मॉड्यूल ओव्हरलॅप आणि सेल प्रकार-विशिष्ट जनुकांच्या संदर्भ सूचीचे विश्लेषण करून निर्धारित केले जाते. ही जनुके पृथक माऊस न्यूरॉन्स, एंडोथेलियल आणि ग्लिअल पेशींमधील प्रकाशित डेटामधून मिळविली जातात. RNA अनुक्रमण (RNA-seq) प्रयोग (29).
(A) मेंदूच्या प्रोटीओमचा WGCNA शोधा. (बी) सीईआरएडी (एβ प्लेक) आणि ब्राक (टाऊ टँगल्स) स्कोअरसह एडी न्यूरोपॅथॉलॉजिकल वैशिष्ट्यांसह (टॉप) मॉड्यूलर सिग्नेचर प्रोटीन (मॉड्युलर प्रोटीन एक्सप्रेशनचा पहिला प्रमुख घटक) चे बायवेट मिडकॉरिलेशन (बायकोर) विश्लेषण. सकारात्मक (लाल) आणि नकारात्मक (निळा) सहसंबंधांची तीव्रता दोन-रंगाच्या उष्णतेच्या नकाशाद्वारे दर्शविली जाते आणि तारे सांख्यिकीय महत्त्व (पी <0.05) दर्शवतात. प्रत्येक प्रोटीन मॉड्युलच्या सेल प्रकार असोसिएशनचे मूल्यांकन करण्यासाठी Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (तळाशी) वापरा. लाल शेडिंगची तीव्रता सेल प्रकार संवर्धनाची डिग्री दर्शवते आणि तारांकन सांख्यिकीय महत्त्व (पी <0.05) दर्शवते. FET मधून मिळवलेले P मूल्य दुरुस्त करण्यासाठी BH पद्धत वापरा. (C) मॉड्यूलर प्रथिनांचे GO विश्लेषण. प्रत्येक मॉड्यूल किंवा संबंधित मॉड्यूल गटासाठी सर्वात जवळून संबंधित जैविक प्रक्रिया दर्शविल्या जातात. oligo, oligodendrocyte.
पाच जवळून संबंधित ॲस्ट्रोसाइट आणि मायक्रोग्लिया-समृद्ध मॉड्यूल्स (M30, M29, M18, M24, आणि M5) च्या संचाने AD न्यूरोपॅथॉलॉजी (आकृती 2B) सह मजबूत सकारात्मक संबंध दर्शविला. ऑन्टोलॉजी विश्लेषण या ग्लिअल मॉड्यूल्सना सेल वाढ, प्रसार आणि प्रतिकारशक्ती (आकृती 2C आणि टेबल S2E) सह जोडते. दोन अतिरिक्त ग्लियाल मॉड्यूल्स, M8 आणि M22, देखील रोगामध्ये जोरदारपणे वाढलेले आहेत. M8 टोल-समान रिसेप्टर मार्गाशी अत्यंत संबंधित आहे, एक सिग्नलिंग कॅस्केड जो जन्मजात रोगप्रतिकारक प्रतिसादात महत्त्वाची भूमिका बजावतो (30). त्याच वेळी, M22 पोस्ट-अनुवादात्मक बदलांशी जवळून संबंधित आहे. M2, जे ऑलिगोडेंड्रोसाइट्समध्ये समृद्ध आहे, एडी पॅथॉलॉजीशी मजबूत सकारात्मक संबंध आणि न्यूक्लियोसाइड संश्लेषण आणि डीएनए प्रतिकृतीसह एक ऑन्टोलॉजिकल कनेक्शन दर्शविते, जे रोगांमध्ये वर्धित सेल प्रसार दर्शवते. एकूणच, हे निष्कर्ष ग्लिअल मॉड्यूल्सच्या उन्नतीला समर्थन देतात जे आम्ही पूर्वी एडी नेटवर्क प्रोटीओम (13, 17) मध्ये पाहिले आहे. सध्या असे आढळून आले आहे की नेटवर्कमधील अनेक AD-संबंधित ग्लियाल मॉड्यूल्स नियंत्रण आणि PD प्रकरणांमध्ये कमी अभिव्यक्ती पातळी दर्शवितात, AD (आकृती S2C) मध्ये वाढलेली त्यांची रोग विशिष्टता हायलाइट करतात.
आमच्या नेटवर्क प्रोटीओममधील फक्त चार मॉड्यूल्स (M1, M3, M10, आणि M32) AD पॅथॉलॉजी (P <0.05) (आकृती 2, B आणि C) सह जोरदारपणे नकारात्मकरित्या संबंधित आहेत. M1 आणि M3 दोन्ही न्यूरोनल मार्करमध्ये समृद्ध आहेत. M1 हा सिनॅप्टिक सिग्नलशी अत्यंत संबंधित आहे, तर M3 हा माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शनशी जवळचा संबंध आहे. M10 आणि M32 साठी सेल प्रकार संवर्धनाचा कोणताही पुरावा नाही. M32 M3 आणि सेल चयापचय यांच्यातील संबंध प्रतिबिंबित करतो, तर M10 सेल वाढ आणि मायक्रोट्यूब्यूल फंक्शनशी अत्यंत संबंधित आहे. AD च्या तुलनेत, सर्व चार मॉड्यूल्स नियंत्रण आणि PD मध्ये वाढले आहेत, त्यांना रोग-विशिष्ट एडी बदल (आकृती S2C) देतात. एकूणच, हे परिणाम न्यूरॉन-समृद्ध मॉड्यूल्सच्या कमी झालेल्या विपुलतेचे समर्थन करतात जे आम्ही पूर्वी एडी (13, 17) मध्ये पाहिले आहे. सारांश, आम्ही शोधलेल्या ब्रेन प्रोटीओमच्या नेटवर्क विश्लेषणाने आमच्या मागील निष्कर्षांशी सुसंगत AD-विशिष्टपणे बदललेले मॉड्यूल्स तयार केले.
एडी हे प्रारंभिक लक्षणे नसलेल्या अवस्थेद्वारे वैशिष्ट्यीकृत आहे (AsymAD), ज्यामध्ये व्यक्ती क्लिनिकल संज्ञानात्मक घट न होता (5, 31) अमायलोइड संचय प्रदर्शित करतात. ही लक्षणे नसलेला टप्पा लवकर ओळख आणि हस्तक्षेप करण्यासाठी एक गंभीर विंडो दर्शवते. आम्ही यापूर्वी स्वतंत्र डेटा सेटमध्ये AsymAD आणि AD ब्रेन नेटवर्क प्रोटीओमचे मजबूत मॉड्यूलर संरक्षण प्रदर्शित केले आहे (13, 17). आम्ही सध्या शोधलेले मेंदूचे नेटवर्क या मागील निष्कर्षांशी सुसंगत आहे याची खात्री करण्यासाठी, आम्ही 27 DLPFC संस्थांकडून प्रतिकृत डेटा सेटमध्ये 44 मॉड्यूल्सच्या संरक्षणाचे विश्लेषण केले. या संस्थांमध्ये नियंत्रण (n = 10), AsymAD (n = 8 ) आणि AD (n = 9) प्रकरणे समाविष्ट आहेत. आमच्या शोध ब्रेन कोहॉर्ट (टेबल S1B) च्या विश्लेषणामध्ये नियंत्रण आणि AD नमुने समाविष्ट केले गेले होते, तर AsymAD प्रकरणे केवळ प्रतिकृती समूहात अद्वितीय होती. ही AsymAD प्रकरणे देखील Emory Goizueta ADRC ब्रेन बँकेतून आली आहेत. मृत्यूच्या वेळी अनुभूती सामान्य असली तरी, amyloid पातळी असामान्यपणे जास्त होती (म्हणजे CERAD, 2.8 ± 0.5) (टेबल S1B).
या 27 मेंदूच्या ऊतींच्या TMT-MS विश्लेषणामुळे 11,244 प्रोटीओम्सचे प्रमाणीकरण झाले. या अंतिम गणनेमध्ये कमीतकमी 50% नमुन्यांमध्ये केवळ त्या प्रथिनांचा समावेश होतो. या प्रतिरूपित डेटा सेटमध्ये आमच्या शोध मेंदूच्या विश्लेषणामध्ये आढळलेल्या 8817 प्रथिनांपैकी 8638 (98.0%) समाविष्ट आहेत आणि नियंत्रण आणि एडी कोहॉर्ट्स दरम्यान जवळजवळ 3000 लक्षणीय बदललेली प्रथिने आहेत (P <0.05, भिन्नतेच्या विश्लेषणासाठी Tukey च्या पेअर टी चाचणीनंतर) ( टेबल S2F). या विभेदकपणे व्यक्त केलेल्या प्रथिनांपैकी, 910 ने एडी आणि ब्रेन प्रोटीओम कंट्रोल केसेस (पी <0.05, ANOVA Tukey पेअर टी-टेस्ट नंतर) दरम्यान लक्षणीय पातळी बदल देखील दर्शविला. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की हे 910 मार्कर प्रोटीओम (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (आकृती S3A) मधील बदलाच्या दिशेने अत्यंत सुसंगत आहेत. वाढलेल्या प्रथिनांपैकी, डेटा संचांमध्ये सर्वाधिक सातत्यपूर्ण बदल असलेली प्रथिने प्रामुख्याने ग्लियाल-समृद्ध M5 आणि M18 मॉड्यूल्स (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 आणि GFAP) चे सदस्य आहेत. कमी झालेल्या प्रथिनांपैकी, ज्यांच्यामध्ये सर्वाधिक सातत्यपूर्ण बदल आहेत ते जवळजवळ केवळ M1 मॉड्यूलचे सदस्य होते (NPTX2, VGF, आणि RPH3A) सायनॅप्सशी संबंधित. आम्ही मिडकाईन (MDK), CD44, स्रावित फ्रिजल्ड-संबंधित प्रोटीन 1 (SFRP1) आणि VGF चे वेस्टर्न ब्लॉटिंग (आकृती S3B) चे एडी-संबंधित बदल सत्यापित केले. मॉड्युल प्रिझर्व्हेशन विश्लेषणाने दर्शविले की मेंदूच्या प्रोटीओममधील सुमारे 80% प्रोटीन मॉड्यूल्स (34/44) प्रतिकृती डेटा सेटमध्ये (z-स्कोअर> 1.96, FDR दुरुस्त P <0.05) (आकृती S3C) मध्ये लक्षणीयरीत्या संरक्षित आहेत. यापैकी चौदा मॉड्यूल दोन प्रोटीओम्स (z-score> 10, FDR दुरुस्त P <1.0 × 10−23) दरम्यान खास राखीव होते. एकूणच, मेंदूच्या प्रोटीओममधील विभेदक अभिव्यक्ती आणि मॉड्यूलर रचनामधील उच्च दर्जाच्या सुसंगततेचा शोध आणि प्रतिकृती एडी फ्रंटल कॉर्टेक्स प्रोटीनमधील बदलांच्या पुनरुत्पादनक्षमतेवर प्रकाश टाकते. याव्यतिरिक्त, हे देखील पुष्टी केली की AsymAD आणि अधिक प्रगत रोगांमध्ये मेंदूच्या नेटवर्कची रचना खूप समान आहे.
मेंदूच्या प्रतिकृती डेटा सेटमधील विभेदक अभिव्यक्तीचे अधिक तपशीलवार विश्लेषण AsymAD आणि नियंत्रण (P <0.05) (आकृती S3D) दरम्यान एकूण 151 लक्षणीय बदललेल्या प्रथिनांसह AsymAD प्रथिने बदलांची महत्त्वपूर्ण डिग्री हायलाइट करते. ॲमिलॉइड लोडशी सुसंगत, AsymAD आणि AD च्या मेंदूतील APP लक्षणीय वाढली. MAPT केवळ AD मध्ये लक्षणीय बदलते, जे गुंतागुंतीच्या वाढीव पातळीशी सुसंगत आहे आणि संज्ञानात्मक घट (5, 7) सह ज्ञात सहसंबंध आहे. ग्लियल-रिच मॉड्यूल्स (M5 आणि M18) AsymAD मधील वाढलेल्या प्रथिनांमध्ये अत्यंत परावर्तित होतात, तर न्यूरॉन-संबंधित M1 मॉड्यूल AsymAD मधील कमी झालेल्या प्रथिनांचे सर्वात प्रतिनिधी आहे. यापैकी बरेच AsymAD मार्कर लक्षणात्मक रोगांमध्ये मोठे बदल दर्शवतात. या मार्करमध्ये SMOC1, M18 चे ग्लियल प्रोटीन आहे, जे मेंदूच्या गाठी आणि डोळे आणि हातपायांच्या विकासाशी संबंधित आहे (32). MDK हा पेशींच्या वाढीशी संबंधित हेपरिन-बाइंडिंग वाढ घटक आहे आणि एंजियोजेनेसिस (33), M18 चा आणखी एक सदस्य आहे. नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, AsymAD मध्ये लक्षणीय वाढ झाली, त्यानंतर एडीमध्ये मोठी वाढ झाली. याउलट, सिनॅप्टिक प्रोटीन न्यूरोपेन्ट्रॅक्सिन 2 (NPTX2) AsymAD मेंदूमध्ये लक्षणीयरीत्या कमी झाले. NPTX2 पूर्वी न्यूरोडीजनरेशनशी संबंधित होता आणि उत्तेजक सिनॅप्सेस (34) मध्यस्थी करण्यात त्याची मान्यताप्राप्त भूमिका आहे. एकूणच, हे परिणाम एडी मधील विविध प्रीक्लिनिकल प्रथिने बदल प्रकट करतात जे रोगाच्या तीव्रतेसह प्रगती करतात असे दिसते.
मेंदूच्या प्रोटीओमच्या शोधात आम्ही प्रथिने कव्हरेजची महत्त्वपूर्ण खोली गाठली आहे हे लक्षात घेता, आम्ही नेटवर्क-स्तरीय AD ट्रान्सक्रिप्टोमसह त्याचे ओव्हरलॅप अधिक पूर्णपणे समजून घेण्याचा प्रयत्न करीत आहोत. म्हणून, आम्ही AD (n = 308) आणि नियंत्रण (n = 157) DLPFC टिश्यूज (13) मधील 18,204 जनुकांच्या मायक्रोएरे मापनातून तयार केलेल्या मॉड्यूलशी आम्ही शोधलेल्या मेंदूच्या प्रोटीओमची तुलना केली. आच्छादित एकूण, आम्ही 20 भिन्न RNA मॉड्यूल ओळखले, ज्यापैकी अनेकांनी विशिष्ट पेशी प्रकारांचे संवर्धन केले, ज्यात न्यूरॉन्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, ॲस्ट्रोसाइट्स आणि मायक्रोग्लिया (आकृती 3A) यांचा समावेश आहे. AD मधील या मॉड्यूल्सचे अनेक बदल आकृती 3B मध्ये दर्शविले आहेत. सखोल लेबल नसलेले एमएस प्रोटीओम (सुमारे 3000 प्रथिने) (13) वापरून आमच्या मागील प्रोटीन-आरएनए ओव्हरलॅप विश्लेषणाशी सुसंगत, आम्हाला आढळलेल्या मेंदूच्या प्रोटीओम नेटवर्कमधील 44 मॉड्यूल्सपैकी बहुतेक ट्रान्सक्रिप्टोम नेटवर्कमध्ये आहेत. त्यातही कोणतेही महत्त्वपूर्ण ओव्हरलॅप नाही. मेंदूच्या प्रोटीओममध्ये अत्यंत राखून ठेवलेल्या 34 प्रोटीन मॉड्यूल्सचा शोध आणि प्रतिकृती, केवळ 14 (~ 40%) फिशरची अचूक चाचणी (FET) उत्तीर्ण झाले आणि ट्रान्सक्रिप्टोम (आकृती 3A) सह सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण ओव्हरलॅप असल्याचे सिद्ध झाले. DNA नुकसान दुरुस्ती (P-M25 आणि P-M19), प्रोटीन भाषांतर (P-M7 आणि P-M20), RNA बाइंडिंग/स्प्लिसिंग (P-M16 आणि P-M21) आणि प्रोटीन लक्ष्यीकरण (P-M13 आणि P-) सह सुसंगत. M23) ट्रान्सक्रिप्टममधील मॉड्यूलसह ​​ओव्हरलॅप होत नाही. त्यामुळे, सध्याच्या ओव्हरलॅप विश्लेषणामध्ये (१३) सखोल प्रोटीओम डेटा सेट वापरला जात असला तरी, बहुतांश एडी नेटवर्क प्रोटीओम ट्रान्सक्रिप्टोम नेटवर्कवर मॅप केलेले नाहीत.
(A) Hypergeometric FET AD ट्रान्सक्रिप्टोम (टॉप) च्या RNA मॉड्यूलमधील सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करचे संवर्धन आणि AD मेंदूच्या RNA (x-axis) आणि प्रोटीन (y-axis) मॉड्यूल्समधील ओव्हरलॅपची डिग्री दर्शवते. (तळाशी). लाल शेडिंगची तीव्रता शीर्ष पॅनेलमधील सेल प्रकारांच्या संवर्धनाची डिग्री आणि खालच्या पॅनेलमधील मॉड्यूल्सच्या ओव्हरलॅपची तीव्रता दर्शवते. एस्टरिस्क सांख्यिकीय महत्त्व दर्शवतात (पी <0.05). (ब) प्रत्येक ट्रान्सक्रिप्टोम मॉड्यूल आणि एडी स्थितीच्या वैशिष्ट्यपूर्ण जनुकांमधील सहसंबंधाची डिग्री. डावीकडील मॉड्यूल AD (निळा) सह सर्वात नकारात्मकरित्या संबंधित आहेत आणि उजवीकडील AD (लाल) शी सर्वात सकारात्मक संबंध आहेत. लॉग-रूपांतरित BH-सुधारित P मूल्य प्रत्येक सहसंबंधाच्या सांख्यिकीय महत्त्वाची डिग्री दर्शवते. (C) सामायिक सेल प्रकार समृद्धीसह लक्षणीय आच्छादित मॉड्यूल. (D) ओव्हरलॅपिंग मॉड्यूलमध्ये लेबल केलेल्या प्रोटीन (x-अक्ष) आणि RNA (y-अक्ष) च्या लॉग2 फोल्ड बदलाचे सहसंबंध विश्लेषण. संबंधित P मूल्यासह Pearson सहसंबंध गुणांक प्रदर्शित केला जातो. सूक्ष्म, मायक्रोग्लिया; खगोलीय पिंड, astrocytes. सीटी, नियंत्रण.
बहुतेक आच्छादित प्रथिने आणि RNA मॉड्युल्स समान सेल प्रकार संवर्धन प्रोफाइल आणि सातत्यपूर्ण AD बदल दिशानिर्देश (आकृती 3, B आणि C) सामायिक करतात. दुसऱ्या शब्दांत, मेंदूच्या प्रोटीओम (PM1) चे सायनॅप्स-संबंधित M1 मॉड्यूल तीन न्यूरोनल-समृद्ध होमोलोगस RNA मॉड्यूल्स (R-M1, R-M9 आणि R-M16) मध्ये मॅप केलेले आहे, जे AD मध्ये दोन्ही दाखवले आहे. एक कमी पातळी. त्याचप्रमाणे, ग्लियाल-समृद्ध M5 आणि M18 प्रोटीन मॉड्यूल्स ॲस्ट्रोसाइट्स आणि मायक्रोग्लिअल मार्कर (R-M3, R-M7, आणि R-M10) समृद्ध RNA मॉड्यूल्ससह ओव्हरलॅप होतात आणि रोगांच्या वाढीमध्ये मोठ्या प्रमाणात गुंतलेले असतात. दोन डेटा संचांमधील ही सामायिक केलेली मॉड्यूलर वैशिष्ट्ये सेल प्रकार संवर्धन आणि मेंदूच्या प्रोटीओममध्ये आढळलेल्या रोग-संबंधित बदलांना समर्थन देतात. तथापि, आम्ही या सामायिक मॉड्यूल्समधील वैयक्तिक मार्करच्या RNA आणि प्रथिने पातळीमधील अनेक महत्त्वपूर्ण फरक पाहिला. या ओव्हरलॅपिंग मॉड्यूल्समधील रेणूंच्या प्रोटीओमिक्स आणि ट्रान्सक्रिप्टॉमिक्सच्या भिन्न अभिव्यक्तीचे सहसंबंध विश्लेषण (आकृती 3D) ही विसंगती हायलाइट करते. उदाहरणार्थ, एपीपी आणि इतर अनेक ग्लिअल मॉड्यूल प्रोटीन्स (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, आणि SFRP1) ने AD प्रोटीओममध्ये लक्षणीय वाढ दर्शविली, परंतु AD ट्रान्सक्रिप्टममध्ये जवळजवळ कोणताही बदल झाला नाही. हे प्रथिने-विशिष्ट बदल एमायलोइड प्लेक्सशी जवळून संबंधित असू शकतात (23, 35), पॅथॉलॉजिकल बदलांचे स्त्रोत म्हणून प्रोटीओम हायलाइट करतात आणि हे बदल ट्रान्सक्रिप्टममध्ये परावर्तित होऊ शकत नाहीत.
आम्ही शोधलेल्या मेंदू आणि CSF प्रोटीओम्सचे स्वतंत्रपणे विश्लेषण केल्यानंतर, आम्ही मेंदू नेटवर्कच्या पॅथोफिजियोलॉजीशी संबंधित AD CSF बायोमार्कर ओळखण्यासाठी दोन डेटा सेटचे सर्वसमावेशक विश्लेषण केले. आपण प्रथम दोन प्रोटीओमचे ओव्हरलॅप परिभाषित केले पाहिजे. CSF एडी मेंदू (4) मध्ये न्यूरोकेमिकल बदल प्रतिबिंबित करते हे सर्वस्वी मान्य असले तरी, एडी मेंदू आणि CSF प्रोटीओममधील आच्छादनाची अचूक डिग्री अस्पष्ट आहे. आमच्या दोन प्रोटीओममध्ये आढळलेल्या सामायिक जनुक उत्पादनांच्या संख्येची तुलना करून, आम्हाला आढळले की सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये ओळखल्या जाणाऱ्या प्रथिनेंपैकी जवळजवळ 70% (n = 1936) मेंदूमध्ये देखील प्रमाणबद्ध होते (आकृती 4A). यापैकी बहुतेक आच्छादित प्रथिने (n = 1721) डिस्कवरी ब्रेन डेटा सेट (आकृती 4B) मधील 44 सह-अभिव्यक्ती मॉड्यूल्सपैकी एकावर मॅप केलेली आहेत. अपेक्षेप्रमाणे, सहा सर्वात मोठे मेंदू मॉड्यूल्स (M1 ते M6) ने CSF ओव्हरलॅपचे सर्वाधिक प्रमाण प्रदर्शित केले. तथापि, लहान ब्रेन मॉड्यूल्स आहेत (उदाहरणार्थ, M15 आणि M29) जे अनपेक्षितपणे उच्च प्रमाणात ओव्हरलॅप मिळवतात, ब्रेन मॉड्यूलच्या आकारापेक्षा दुप्पट मोठे असतात. हे आम्हाला मेंदू आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमधील ओव्हरलॅपची गणना करण्यासाठी अधिक तपशीलवार, सांख्यिकीय पद्धतीने चालविलेल्या पद्धतीचा अवलंब करण्यास प्रवृत्त करते.
(A आणि B) शोध मेंदू आणि CSF डेटा सेटमध्ये आढळलेली प्रथिने ओव्हरलॅप होतात. यापैकी बहुतेक आच्छादित प्रथिने मेंदूच्या सह-अभिव्यक्ती नेटवर्कच्या 44 सह-अभिव्यक्ती मॉड्यूल्सपैकी एकाशी संबंधित आहेत. (सी) सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड प्रोटीओम आणि ब्रेन नेटवर्क प्रोटीओम यांच्यातील ओव्हरलॅप शोधा. हीट मॅपची प्रत्येक पंक्ती हायपरजॉमेट्रिक FET चे वेगळे ओव्हरलॅप विश्लेषण दर्शवते. शीर्ष पंक्ती ब्रेन मॉड्यूल आणि संपूर्ण CSF प्रोटीओममधील ओव्हरलॅप (राखाडी/काळा शेडिंग) दर्शवते. दुसरी ओळ दर्शवते की मेंदू मॉड्यूल आणि CSF प्रथिने (लाल रंगात शेड केलेले) मधील ओव्हरलॅप AD (P <0.05) मध्ये लक्षणीयरीत्या वर-नियमित आहे. तिसरी पंक्ती दर्शवते की ब्रेन मॉड्यूल्स आणि CSF प्रोटीन (ब्लू शेडिंग) यांच्यातील ओव्हरलॅप एडी (पी <0.05) मध्ये लक्षणीयपणे खाली-नियमित आहे. FET मधून मिळवलेले P मूल्य दुरुस्त करण्यासाठी BH पद्धत वापरा. (डी) सेल प्रकार असोसिएशन आणि संबंधित GO अटींवर आधारित फोल्डिंग मॉड्यूल पॅनेल. या पॅनल्समध्ये एकूण 271 मेंदूशी संबंधित प्रथिने असतात, ज्यांची CSF प्रोटीओममध्ये अर्थपूर्ण विभेदक अभिव्यक्ती असते.
सिंगल-टेलेड एफईटी वापरून, आम्ही सीएसएफ प्रोटीओम आणि वैयक्तिक मेंदू मॉड्यूल्समधील प्रथिने ओव्हरलॅपच्या महत्त्वचे मूल्यांकन केले. विश्लेषणातून असे दिसून आले की CSF डेटा सेटमधील एकूण 14 ब्रेन मॉड्यूल्समध्ये सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण ओव्हरलॅप आहेत (FDR समायोजित P <0.05), आणि एक अतिरिक्त मॉड्यूल (M18) ज्याचे ओव्हरलॅप महत्त्वाच्या जवळ आहे (FDR समायोजित P = 0.06) (आकृती 4C) , शीर्ष पंक्ती). आम्हाला मॉड्यूल्समध्ये देखील स्वारस्य आहे जे भिन्नपणे व्यक्त केलेल्या CSF प्रोटीनसह जोरदारपणे ओव्हरलॅप करतात. म्हणून, AD मध्ये (i) CSF प्रथिने लक्षणीयरीत्या वाढले आणि (ii) CSF प्रथिने AD मध्ये लक्षणीयरीत्या कमी झाली हे निर्धारित करण्यासाठी आम्ही दोन अतिरिक्त FET विश्लेषणे लागू केली (P <0.05, पेअर t test AD/control) अर्थपूर्ण ओव्हरलॅपसह ब्रेन मॉड्यूल्स त्यांच्या दरम्यान. आकृती 4C च्या मधल्या आणि खालच्या पंक्तींमध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, या अतिरिक्त विश्लेषणातून असे दिसून येते की 44 पैकी 8 मेंदूचे मॉड्यूल AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, आणि M38) मध्ये जोडलेल्या प्रथिनेसह लक्षणीयरीत्या ओव्हरलॅप होतात. . ), तर फक्त दोन मॉड्यूल्स (M6 आणि M15) ने AD CSF मध्ये कमी झालेल्या प्रथिनांसह एक अर्थपूर्ण ओव्हरलॅप दर्शविला. अपेक्षेप्रमाणे, सर्व 10 मॉड्यूल CSF प्रोटीओमसह सर्वाधिक ओव्हरलॅप असलेल्या 15 मॉड्यूल्समध्ये आहेत. म्हणून, आम्ही असे गृहीत धरतो की हे 15 मॉड्यूल एडी ब्रेन-व्युत्पन्न CSF बायोमार्कर्सचे उच्च-उत्पन्न स्त्रोत आहेत.
आम्ही हे 15 ओव्हरलॅपिंग मॉड्यूल्स डब्ल्यूजीसीएनए ट्री डायग्राममधील त्यांच्या निकटतेच्या आधारावर पाच मोठ्या प्रोटीन पॅनेलमध्ये दुमडले आणि सेल प्रकार आणि जीन ऑन्टोलॉजी (आकृती 4D) यांच्याशी संबंधित आहेत. पहिल्या पॅनेलमध्ये न्यूरॉन मार्कर आणि सिनॅप्स-संबंधित प्रथिने (M1 आणि M12) समृद्ध मॉड्यूल असतात. सिनॅप्टिक पॅनेलमध्ये एकूण 94 प्रथिने आहेत, आणि CSF प्रोटीओममधील पातळी लक्षणीयरीत्या बदलल्या आहेत, ज्यामुळे ते पाच पॅनेलमध्ये मेंदूशी संबंधित CSF मार्करचा सर्वात मोठा स्रोत बनला आहे. दुसऱ्या गटाने (M6 आणि M15) एंडोथेलियल सेल मार्कर आणि रक्तवहिन्यासंबंधी शरीराशी जवळचा संबंध प्रदर्शित केला, जसे की “जखमा बरे करणे” (M6) आणि “ह्युमरल इम्यून प्रतिसादाचे नियमन” (M15). M15 देखील लिपोप्रोटीन चयापचयशी अत्यंत संबंधित आहे, जो एंडोथेलियम (36) शी जवळून संबंधित आहे. संवहनी पॅनेलमध्ये मेंदूशी संबंधित 34 CSF मार्कर असतात. तिसऱ्या गटात मॉड्यूल्स (M2 आणि M4) समाविष्ट आहेत जे ऑलिगोडेंड्रोसाइट मार्कर आणि सेल प्रसाराशी लक्षणीयपणे संबंधित आहेत. उदाहरणार्थ, M2 च्या उच्च-स्तरीय ऑन्टोलॉजी संज्ञांमध्ये "डीएनए प्रतिकृतीचे सकारात्मक नियमन" आणि "प्युरिन बायोसिंथेसिस प्रक्रिया" समाविष्ट आहे. दरम्यान, M4 मध्ये "ग्लियल सेल डिफरेंशन" आणि "क्रोमोसोम सेग्रेगेशन" यांचा समावेश होतो. मायलिनेशन पॅनेलमध्ये मेंदूशी संबंधित 49 CSF मार्कर असतात.
चौथ्या गटामध्ये सर्वात जास्त मॉड्यूल्स आहेत (M30, M29, M18, M24, आणि M5), आणि जवळजवळ सर्व मॉड्यूल्स मायक्रोग्लिया आणि ॲस्ट्रोसाइट मार्करमध्ये लक्षणीयरीत्या समृद्ध आहेत. मायलिनेशन पॅनेल प्रमाणेच, चौथ्या पॅनेलमध्ये मॉड्यूल (M30, M29, आणि M18) देखील असतात जे सेल प्रसाराशी जवळून संबंधित असतात. या गटातील इतर मॉड्युल्स इम्युनोलॉजिकल अटींशी अत्यंत संबंधित आहेत, जसे की “इम्यून इफेक्ट प्रोसेस” (M5) आणि “इम्यून रिस्पॉन्स रेग्युलेशन” (M24). ग्लियाल इम्यून ग्रुपमध्ये मेंदूशी संबंधित 42 CSF मार्कर असतात. शेवटी, शेवटच्या पॅनेलमध्ये चार मॉड्यूल्स (M44, M3, M33, आणि M38) वर 52 मेंदू-संबंधित मार्कर समाविष्ट आहेत, जे सर्व शरीरावर ऊर्जा साठवण आणि चयापचय संबंधित आहेत. यापैकी सर्वात मोठे मॉड्यूल (M3) मायटोकॉन्ड्रियाशी जवळून संबंधित आहे आणि न्यूरॉन-विशिष्ट मार्करने समृद्ध आहे. M38 या मेटाबोलोममधील लहान मॉड्यूल सदस्यांपैकी एक आहे आणि ते मध्यम न्यूरॉन विशिष्टता देखील प्रदर्शित करते.
एकंदरीत, हे पाच पॅनेल AD कॉर्टेक्समधील सेल प्रकार आणि कार्यांची विस्तृत श्रेणी प्रतिबिंबित करतात आणि एकत्रितपणे 271 मेंदूशी संबंधित CSF मार्कर (टेबल S2G) असतात. या एमएस परिणामांच्या वैधतेचे मूल्यमापन करण्यासाठी, आम्ही प्रॉक्सिमिटी एक्स्टेंशन परख (पीईए), मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता, उच्च संवेदनशीलता आणि विशिष्टता असलेले ऑर्थोगोनल अँटीबॉडी-आधारित तंत्रज्ञान वापरले आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमुन्यांचे पुनर्विश्लेषण केले आम्हाला या 271 बायोमार्कर्सचा उपसंच आढळला. (n = 36). हे 36 लक्ष्य PEA च्या AD मल्टिपलमधील बदल प्रदर्शित करतात, जे आमच्या MS-आधारित निष्कर्षांशी जवळून संबंधित आहे (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), ज्याने आमच्या सर्वसमावेशक MS विश्लेषणाच्या परिणामांची जोरदार पडताळणी केली (आकृती S4 ).
सिनॅप्टिक सिग्नलिंगपासून ऊर्जा चयापचयपर्यंत आमच्या पाच गटांनी भर दिलेल्या जैविक थीम या सर्व एडी (1-3) च्या पॅथोजेनेसिसशी संबंधित आहेत. म्हणून, हे पॅनेल असलेले सर्व 15 मॉड्यूल्स आम्ही शोधलेल्या ब्रेन प्रोटीओममधील एडी पॅथॉलॉजीशी संबंधित आहेत (आकृती 2B). सर्वात लक्षणीय म्हणजे आमच्या ग्लियाल मॉड्यूल्समधील उच्च सकारात्मक पॅथॉलॉजिकल सहसंबंध आणि आमच्या सर्वात मोठ्या न्यूरोनल मॉड्यूल्स (M1 आणि M3) मधील मजबूत नकारात्मक पॅथॉलॉजिकल सहसंबंध. आमच्या प्रतिकृती ब्रेन प्रोटीओमचे विभेदक अभिव्यक्ती विश्लेषण (आकृती S3D) M5 आणि M18-व्युत्पन्न ग्लिअल प्रथिने देखील हायलाइट करते. AsymAD आणि लक्षणात्मक AD मध्ये, सर्वात जास्त वाढलेले ग्लियाल प्रथिने आणि M1-संबंधित सायनॅप्स प्रथिने सर्वात कमी होतात. ही निरीक्षणे सूचित करतात की आम्ही पाच गटांमध्ये ओळखले 271 सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड मार्कर एडी कॉर्टेक्समधील रोग प्रक्रियांशी संबंधित आहेत, ज्यामध्ये प्रारंभिक लक्षणे नसलेल्या अवस्थेत आढळतात.
मेंदू आणि स्पाइनल फ्लुइडमधील पॅनेल प्रथिनांच्या बदलाच्या दिशेने चांगल्या प्रकारे विश्लेषण करण्यासाठी, आम्ही प्रत्येक 15 ओव्हरलॅपिंग मॉड्यूल्ससाठी खालील रेखाटले: (i) मेंदू डेटा सेटमध्ये मॉड्यूलची विपुलता पातळी आढळली आणि (ii) मॉड्यूल प्रथिने सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (आकृती S5) मध्ये फरक व्यक्त केला जातो. आधी सांगितल्याप्रमाणे, WGCNA चा उपयोग मेंदूतील मॉड्यूलची विपुलता किंवा वैशिष्ट्यपूर्ण प्रथिने मूल्य निर्धारित करण्यासाठी केला जातो (13). ज्वालामुखीचा नकाशा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (AD/नियंत्रण) मधील मॉड्यूलर प्रथिनांच्या विभेदक अभिव्यक्तीचे वर्णन करण्यासाठी वापरला जातो. हे आकडे दर्शवतात की पाच पैकी तीन पॅनेल मेंदू आणि स्पाइनल फ्लुइडमधील भिन्न अभिव्यक्ती ट्रेंड दर्शवतात. सायनॅप्स पॅनेलचे दोन मॉड्यूल (M1 आणि M12) एडी मेंदूमधील विपुलतेच्या पातळीत घट दर्शवतात, परंतु एडी सीएसएफ (आकृती S5A) मधील वाढलेल्या प्रथिनेसह लक्षणीयरीत्या ओव्हरलॅप करतात. मेटाबोलोम (M3 आणि M38) असलेल्या न्यूरॉन-संबंधित मॉड्यूल्सने समान मेंदू आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड अभिव्यक्ती नमुने विसंगत (आकृती S5E) दर्शवले. संवहनी पॅनेलने भिन्न अभिव्यक्ती ट्रेंड देखील दर्शविला, जरी त्याचे मॉड्यूल (M6 आणि M15) एडी मेंदूमध्ये माफक प्रमाणात वाढले आणि रोगग्रस्त CSF (आकृती S5B) मध्ये कमी झाले. उर्वरित दोन पॅनेलमध्ये मोठे ग्लियाल नेटवर्क आहेत ज्यांचे प्रथिने दोन्ही कंपार्टमेंटमध्ये (आकृती S5, C आणि D) सातत्याने वर-नियमित असतात.
कृपया लक्षात घ्या की हे ट्रेंड या पॅनेलमधील सर्व मार्करसाठी सामान्य नाहीत. उदाहरणार्थ, सिनॅप्टिक पॅनेलमध्ये अनेक प्रथिने समाविष्ट आहेत जी एडी मेंदू आणि CSF (आकृती S5A) मध्ये लक्षणीयरीत्या कमी होतात. या डाउन-रेग्युलेट केलेल्या सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड मार्करमध्ये M1 चे NPTX2 आणि VGF आणि M12 चे क्रोमोग्रॅनिन B आहेत. तथापि, हे अपवाद असूनही, आमचे बहुतेक सिनॅप्टिक मार्कर एडी स्पाइनल फ्लुइडमध्ये वाढलेले आहेत. एकूणच, ही विश्लेषणे आमच्या प्रत्येक पाच पॅनेलमधील मेंदू आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड पातळीमधील सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण ट्रेंड ओळखण्यात सक्षम होती. हे ट्रेंड एडी मधील मेंदू आणि CSF प्रथिने अभिव्यक्तीमधील जटिल आणि अनेकदा भिन्न संबंध हायलाइट करतात.
त्यानंतर, आम्ही आमच्या बायोमार्कर्सचा 271 संच सर्वात आश्वासक आणि पुनरुत्पादक लक्ष्यांपर्यंत (आकृती 5A) कमी करण्यासाठी उच्च-थ्रूपुट एमएस प्रतिकृती विश्लेषण (CSF प्रतिकृती 1) वापरले. CSF कॉपी 1 मध्ये Emory Goizueta ADRC चे एकूण 96 नमुने आहेत, ज्यात कंट्रोल, AsymAD आणि AD cohort (टेबल S1A) यांचा समावेश आहे. ही एडी प्रकरणे सौम्य संज्ञानात्मक घट (म्हणजे MoCA, 20.0 ± 3.8) आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (टेबल S1A) मध्ये पुष्टी झालेल्या AD बायोमार्करमधील बदलांद्वारे वैशिष्ट्यीकृत आहेत. आम्हाला आढळलेल्या CSF विश्लेषणाच्या विरूद्ध, ही प्रतिकृती अधिक कार्यक्षम आणि उच्च-थ्रूपुट "सिंगल-शॉट" एमएस पद्धत (ऑफ-लाइन फ्रॅक्शनेशनशिवाय) वापरून केली जाते, ज्यामध्ये वैयक्तिक नमुन्यांची प्रतिकारशक्ती कमी करण्याची आवश्यकता दूर करणाऱ्या सरलीकृत नमुना तयारी प्रोटोकॉलचा समावेश आहे. . त्याऐवजी, कमी मुबलक प्रथिने (37) चे सिग्नल वाढवण्यासाठी एकच रोगप्रतिकार-कमी झालेले "वर्धन चॅनेल" वापरले जाते. हे एकूण प्रोटीओम कव्हरेज कमी करत असले तरी, ही सिंगल-शॉट पद्धत मशीनचा वेळ लक्षणीयरीत्या कमी करते आणि TMT-लेबल केलेल्या नमुन्यांची संख्या वाढवते ज्यांचे व्यवहार्य विश्लेषण केले जाऊ शकते (17, 38). एकूण, विश्लेषणाने 6,487 पेप्टाइड्स ओळखले, जे 96 प्रकरणांमध्ये 1,183 प्रोटीओम्सवर मॅप केले गेले. आम्हाला आढळलेल्या CSF विश्लेषणाप्रमाणे, किमान 50% नमुन्यांमध्ये केवळ त्या प्रथिनांचे प्रमाण नंतरच्या गणनेमध्ये समाविष्ट केले गेले होते आणि वय आणि लिंग यांच्या प्रभावांसाठी डेटा मागे घेण्यात आला होता. यामुळे 792 प्रोटीओमचे अंतिम प्रमाणीकरण झाले, त्यापैकी 95% CSF डेटा सेटमध्ये देखील ओळखले गेले.
(A) मेंदूशी संबंधित CSF प्रथिने लक्ष्ये पहिल्या प्रतिकृतीत CSF गटामध्ये सत्यापित केली गेली आणि अंतिम पॅनेलमध्ये समाविष्ट केली गेली (n = 60). (B ते E) पॅनेल बायोमार्कर स्तर (संमिश्र z-स्कोअर) चार CSF प्रतिकृती समूहांमध्ये मोजले जातात. पेअर केलेल्या टी-चाचण्या किंवा ANOVA प्रत्येक प्रतिकृती विश्लेषणामध्ये विपुलतेतील बदलांचे सांख्यिकीय महत्त्व मूल्यमापन करण्यासाठी Tukey च्या पोस्ट-करेक्शनसह वापरले गेले. सीटी, नियंत्रण.
आमची 271 मेंदू-संबंधित CSF लक्ष्ये सर्वसमावेशक विश्लेषणाद्वारे सत्यापित करण्यात आम्हाला विशेष स्वारस्य असल्याने, आम्ही या प्रतिरूपित प्रोटीओमची पुढील तपासणी या मार्करपर्यंत मर्यादित करू. या 271 प्रथिनांपैकी, 100 CSF प्रतिकृती 1 मध्ये आढळून आले. आकृती S6A नियंत्रण आणि AD प्रतिकृती नमुन्यांमधील या 100 ओव्हरलॅपिंग मार्करची भिन्नता दर्शविते. AD मध्ये सिनेप्टिक आणि मेटाबोलाइट हिस्टोन सर्वात जास्त वाढतात, तर रक्तवहिन्यासंबंधी प्रथिने रोगामध्ये सर्वात कमी होतात. बहुतेक 100 ओव्हरलॅपिंग मार्कर (n = 70) ने दोन डेटा सेटमध्ये बदलाची समान दिशा राखली (आकृती S6B). हे 70 प्रमाणित मेंदू-संबंधित CSF मार्कर (टेबल S2H) मोठ्या प्रमाणात पूर्वी पाहिलेले पॅनेल अभिव्यक्ती ट्रेंड प्रतिबिंबित करतात, म्हणजे, संवहनी प्रथिनांचे डाउन-रेग्युलेशन आणि इतर सर्व पॅनेलचे अप-रेग्युलेशन. या 70 प्रमाणित प्रथिनांपैकी केवळ 10 प्रथिनांनी AD विपुलतेमध्ये बदल दर्शविला ज्याने या पॅनेलच्या ट्रेंडचा विरोध केला. मेंदू आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडचा एकंदर ट्रेंड उत्तम प्रकारे प्रतिबिंबित करणारे पॅनेल तयार करण्यासाठी, आम्ही शेवटी सत्यापित केलेल्या स्वारस्याच्या पॅनेलमधून आम्ही ही 10 प्रथिने वगळली (आकृती 5A). म्हणून, आमच्या पॅनेलमध्ये भिन्न नमुना तयार करणे आणि एमएस प्लॅटफॉर्म विश्लेषण वापरून दोन स्वतंत्र CSF AD समूहांमध्ये सत्यापित केलेल्या एकूण 60 प्रथिने समाविष्ट आहेत. CSF कॉपी 1 कंट्रोल आणि AD प्रकरणांमधील या अंतिम पॅनेलच्या z-स्कोर अभिव्यक्ती प्लॉट्सने आम्हाला आढळलेल्या CSF कोहॉर्टमध्ये पाहिल्या गेलेल्या पॅनेल ट्रेंडची पुष्टी केली (आकृती 5B).
या 60 प्रथिनांमध्ये, AD शी संबंधित असलेले रेणू आहेत, जसे की ऑस्टियोपॉन्टीन (SPP1), जो एक प्रो-इंफ्लॅमेटरी सायटोकाइन आहे जो अनेक अभ्यासांमध्ये (39-41) AD शी संबंधित आहे, आणि GAP43, एक सिनॅप्टिक प्रोटीन आहे. जे स्पष्टपणे न्यूरोडीजनरेशनशी जोडलेले आहे (42). सर्वात पूर्णतः सत्यापित प्रथिने इतर न्यूरोडीजनरेटिव्ह रोगांशी संबंधित मार्कर आहेत, जसे की अमायोट्रॉफिक लॅटरल स्क्लेरोसिस (ALS) संबंधित सुपरऑक्साइड डिसम्युटेस 1 (SOD1) आणि पार्किन्सन रोग संबंधित डेसॅचरेस (PARK7). आम्ही हे देखील सत्यापित केले आहे की SMOC1 आणि ब्रेन-रिच मेम्ब्रेन अटॅचमेंट सिग्नलिंग प्रोटीन 1 (BASP1) सारख्या इतर अनेक मार्करचा न्यूरोडीजनरेशनशी पूर्वीचा संबंध मर्यादित आहे. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की CSF प्रोटीओममध्ये त्यांच्या कमी एकंदर विपुलतेमुळे, MAPT आणि काही इतर AD-संबंधित प्रथिने (उदाहरणार्थ, NEFL आणि NRGN) विश्वासार्हपणे शोधण्यासाठी ही उच्च-थ्रूपुट सिंगल-शॉट डिटेक्शन पद्धत वापरणे आमच्यासाठी कठीण आहे. ) ( ४३, ४४).
त्यानंतर आम्ही तीन अतिरिक्त प्रतिकृती विश्लेषणांमध्ये हे 60 प्राधान्य पॅनेल मार्कर तपासले. CSF कॉपी 2 मध्ये, Emory Goizueta ADRC (17) कडील 297 नियंत्रण आणि AD नमुन्यांच्या स्वतंत्र गटाचे विश्लेषण करण्यासाठी आम्ही एकल TMT-MS वापरले. CSF प्रतिकृती 3 मध्ये 120 नियंत्रणाकडील उपलब्ध TMT-MS डेटाचे पुनर्विश्लेषण आणि लॉसने, स्वित्झर्लंड (45) येथील एडी रुग्णांचा समावेश आहे. आम्हाला प्रत्येक डेटासेटमध्ये 60 प्राधान्य मार्करपैकी दोन-तृतीयांशपेक्षा जास्त आढळले. जरी स्विस अभ्यासामध्ये विविध MS प्लॅटफॉर्म आणि TMT प्रमाणीकरण पद्धती (45, 46) वापरल्या गेल्या असल्या तरी, आम्ही आमच्या पॅनेलचे ट्रेंड दोन पुनरावृत्ती केलेल्या विश्लेषणांमध्ये (आकृती 5, C आणि D, ​​आणि S2, I, आणि J) जोरदारपणे पुनरुत्पादित केले. आमच्या गटाच्या रोगाच्या विशिष्टतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही चौथ्या प्रतिकृती डेटा सेटचे विश्लेषण करण्यासाठी TMT-MS वापरला (CSF प्रतिकृती 4), ज्यामध्ये केवळ नियंत्रण (n = 18) आणि AD (n = 17) प्रकरणेच नाहीत तर PD (n = 17) देखील समाविष्ट आहेत. n = 14)), ALS (n = 18) आणि फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया (FTD) नमुने (n = 11) (टेबल S1A). आम्ही या गटातील पॅनेल प्रथिनांपैकी जवळजवळ दोन-तृतीयांश प्रथिने यशस्वीरित्या मोजली (60 पैकी 38). हे परिणाम सर्व पाच बायोमार्कर पॅनेलमधील AD-विशिष्ट बदल हायलाइट करतात (आकृती 5E आणि टेबल S2K). चयापचय गटातील वाढीने सर्वात मजबूत AD विशिष्टता दर्शविली, त्यानंतर मायलिनेशन आणि ग्लिअल गट. काही प्रमाणात, FTD देखील या पॅनेलमधील वाढ दर्शविते, जे समान संभाव्य नेटवर्क बदल दर्शवू शकतात (17). याउलट, ALS आणि PD ने नियंत्रण गटाप्रमाणे जवळजवळ समान मायलिनेशन, ग्लिअल आणि मेटाबोलोम प्रोफाइल दर्शवले. एकंदरीत, नमुना तयार करणे, MS प्लॅटफॉर्म आणि TMT प्रमाणीकरण पद्धतींमध्ये फरक असूनही, हे वारंवार केलेले विश्लेषण असे दर्शविते की आमच्या प्राधान्य पॅनेल मार्करमध्ये 500 पेक्षा जास्त अद्वितीय CSF नमुन्यांमध्ये AD-विशिष्ट बदल आहेत.
संज्ञानात्मक लक्षणे सुरू होण्याच्या अनेक वर्षांपूर्वी एडी न्यूरोडीजनरेशन व्यापकपणे ओळखले गेले आहे, म्हणून एसीएमएडी (5, 31) च्या बायोमार्कर्सची त्वरित आवश्यकता आहे. तथापि, अधिकाधिक पुरावे दर्शवतात की AsymAD चे जीवशास्त्र एकसंधतेपासून दूर आहे, आणि जोखीम आणि लवचिकता यांच्या जटिल परस्परसंवादामुळे रोगाच्या पुढील प्रगतीमध्ये मोठ्या प्रमाणात वैयक्तिक फरक होतो (47). AsymAD प्रकरणे ओळखण्यासाठी वापरले जात असले तरी, कोर CSF बायोमार्कर (Aβ1-42, एकूण tau आणि p-tau) चे स्तर हे सिद्ध झालेले नाही की कोण डिमेंशिया (4, 7) मध्ये प्रगती करेल, हे अधिक सूचित करते. या लोकसंख्येच्या जोखमीचे अचूक स्तरीकरण करण्यासाठी मेंदूच्या शरीरविज्ञानाच्या अनेक पैलूंवर आधारित समग्र बायोमार्कर साधने समाविष्ट करणे आवश्यक आहे. म्हणून, आम्ही नंतर CSF कॉपी 1 च्या AsymAD लोकसंख्येमध्ये आमच्या AD-प्रमाणित बायोमार्कर पॅनेलचे विश्लेषण केले. या 31 AsymAD प्रकरणांमध्ये असामान्य कोर बायोमार्कर पातळी (Aβ1–42/एकूण tau ELISA प्रमाण, <5.5) आणि पूर्ण आकलन (म्हणजे MoCA, 27. ± 2.2) (टेबल S1A). याव्यतिरिक्त, AsymAD असलेल्या सर्व व्यक्तींचा क्लिनिकल डिमेंशिया स्कोअर 0 आहे, जे सूचित करते की दैनंदिन संज्ञानात्मक किंवा कार्यात्मक कार्यक्षमतेत घट झाल्याचा कोणताही पुरावा नाही.
AsymAD कोहॉर्टसह आम्ही सर्व 96 CSF प्रतिकृती 1 मध्ये प्रमाणित पॅनेलच्या स्तरांचे प्रथम विश्लेषण केले. आम्हाला आढळले की AsymAD समुहातील अनेक पॅनेलमध्ये AD सारखे विपुलतेचे लक्षणीय बदल झाले आहेत, संवहनी पॅनेलने AsymAD मधील खालचा कल दर्शविला आहे, तर इतर सर्व पॅनेलने वरचा कल दर्शविला आहे (आकृती 6A). म्हणून, सर्व पॅनेलने ELISA Aβ1-42 आणि एकूण टाऊ पातळी (आकृती 6B) सह अत्यंत महत्त्वपूर्ण सहसंबंध दर्शविला. याउलट, गट आणि MoCA स्कोअरमधील परस्परसंबंध तुलनेने खराब आहे. या विश्लेषणातून मिळालेल्या अधिक धक्कादायक निष्कर्षांपैकी एक म्हणजे AsymAD समूहातील पॅनेल विपुलतेची मोठी श्रेणी. आकृती 6A मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, AsymAD गटाची पॅनेल पातळी सामान्यतः नियंत्रण गट आणि AD गटाची पॅनेल पातळी ओलांडते, तुलनेने उच्च परिवर्तनशीलता दर्शविते. AsymAD ची ही विषमता अधिक एक्सप्लोर करण्यासाठी, आम्ही 96 CSF प्रतिकृती 1 प्रकरणांमध्ये बहुआयामी स्केलिंग (MDS) विश्लेषण लागू केले. एमडीएस विश्लेषण डेटा सेटमधील विशिष्ट व्हेरिएबल्सवर आधारित प्रकरणांमधील समानतेची कल्पना करण्यास अनुमती देते. या क्लस्टर विश्लेषणासाठी, आम्ही CSF शोध आणि प्रतिकृती 1 प्रोटीओम (n = 29) (टेबल S2L) स्तरामध्ये सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण बदल (P <0.05, AD/control) असलेले प्रमाणित पॅनेल मार्कर वापरतो. या विश्लेषणाने आमचे नियंत्रण आणि एडी प्रकरणे (आकृती 6C) दरम्यान स्पष्ट अवकाशीय क्लस्टरिंग तयार केले. याउलट, काही AsymAD प्रकरणे नियंत्रण गटात स्पष्टपणे क्लस्टर केलेली आहेत, तर इतर AD प्रकरणांमध्ये स्थित आहेत. या AsymAD विषमतेचे आणखी अन्वेषण करण्यासाठी, आम्ही या AsymAD प्रकरणांचे दोन गट परिभाषित करण्यासाठी आमचा MDS नकाशा वापरला. पहिल्या गटामध्ये नियंत्रणाच्या जवळ क्लस्टर केलेल्या AsymAD प्रकरणांचा समावेश होता (n = 19), तर दुसरा गट AD (n = 12) च्या जवळ मार्कर प्रोफाइलसह AsymAD प्रकरणांद्वारे वैशिष्ट्यीकृत होता.
(A) AsymAD सह CSF प्रतिकृती 1 समूहातील सर्व 96 नमुन्यांमधील CSF बायोमार्कर गटाची अभिव्यक्ती पातळी (z-स्कोअर). पॅनेल विपुलता बदलांच्या सांख्यिकीय महत्त्वाचे मूल्यांकन करण्यासाठी तुकीच्या पोस्ट-करेक्शनसह भिन्नतेचे विश्लेषण वापरले गेले. (ब) एमओसीए स्कोअरसह पॅनेल प्रोटीन विपुलता पातळीचे (z-स्कोअर) सहसंबंध विश्लेषण आणि एलिसा Aβ1-42 आणि CSF कॉपी 1 नमुन्यांमधील एकूण टाऊ पातळी. संबंधित P मूल्यासह Pearson सहसंबंध गुणांक प्रदर्शित केला जातो. (C) 96 CSF कॉपी 1 प्रकरणांचे MDS 29 प्रमाणित पॅनेल मार्करच्या विपुलतेच्या स्तरांवर आधारित होते, जे शोध आणि CSF कॉपी 1 डेटा सेट [P <0.05 AD/control (CT)] या दोन्हीमध्ये लक्षणीयरीत्या बदलले होते. हे विश्लेषण AsymAD गटाला नियंत्रण (n = 19) आणि AD (n = 12) उपसमूहांमध्ये विभाजित करण्यासाठी वापरले गेले. (D) ज्वालामुखी प्लॉट दोन AsymAD उपसमूहांमधील -log10 सांख्यिकीय P मूल्याच्या सापेक्ष लॉग2 फोल्ड चेंज (x-अक्ष) सह सर्व CSF प्रतिकृती 1 प्रोटीनची भिन्नता दर्शवितो. पॅनेल बायोमार्कर रंगीत आहेत. (ई) CSF प्रतिकृती 1 निवड गट बायोमार्कर्सची विपुलता पातळी AsymAD उपसमूहांमध्ये भिन्नपणे व्यक्त केली जाते. तुकेचे भिन्नतेचे पोस्ट-समायोजित विश्लेषण सांख्यिकीय महत्त्वाचे मूल्यांकन करण्यासाठी वापरले गेले.
आम्ही या नियंत्रण आणि AD-सारखी AsymAD प्रकरणे (आकृती 6D आणि सारणी S2L) दरम्यान भिन्न प्रोटीन अभिव्यक्ती तपासली. परिणामी ज्वालामुखीचा नकाशा दर्शवितो की दोन गटांमध्ये 14 पॅनेल मार्कर लक्षणीय बदलले आहेत. यापैकी बहुतेक मार्कर सायनॅप्स आणि मेटाबोलोमचे सदस्य आहेत. तथापि, SOD1 आणि myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate (MARCKS), जे अनुक्रमे मायलिन आणि ग्लिअल रोगप्रतिकारक गटांचे सदस्य आहेत, ते देखील या गटाशी संबंधित आहेत (आकृती 6, D आणि E). संवहनी पॅनेलने दोन मार्कर देखील योगदान दिले जे AD-सारख्या AsymAD गटामध्ये लक्षणीयरीत्या कमी झाले होते, ज्यात AE बंधनकारक प्रोटीन 1 (AEBP1) आणि कुटुंबातील सदस्य C9 यांचा समावेश आहे. ELISA AB1-42 (P = 0.38) आणि p-tau (P = 0.28) मधील नियंत्रण आणि AD-सारख्या AsymAD उपसमूहांमध्ये कोणताही महत्त्वाचा फरक नव्हता, परंतु एकूण ताऊ पातळी (P = 0.0031) मध्ये खरोखरच लक्षणीय फरक होता. ) (Fig. S7). दोन AsymAD उपसमूहांमधील बदल एकूण टाऊ पातळींपेक्षा (उदाहरणार्थ, YWHAZ, SOD1 आणि MDH1) (आकृती 6E) पेक्षा अधिक लक्षणीय असल्याचे दर्शवणारे अनेक पॅनेल मार्कर आहेत. एकंदरीत, हे परिणाम सूचित करतात की आमच्या प्रमाणित पॅनेलमध्ये बायोमार्कर असू शकतात जे लक्षणे नसलेल्या रोग असलेल्या रुग्णांचे उपप्रकार आणि संभाव्य जोखीम स्तरीकरण करू शकतात.
एडीमागील विविध पॅथोफिजियोलॉजी चांगल्या प्रकारे मोजण्यासाठी आणि लक्ष्य करण्यासाठी सिस्टम-आधारित बायोमार्कर साधनांची तातडीची गरज आहे. ही साधने केवळ आमची एडी डायग्नोस्टिक फ्रेमवर्कच बदलणार नाहीत तर प्रभावी, रुग्ण-विशिष्ट उपचार धोरणे (1, 2) च्या अवलंबना प्रोत्साहन देईल अशी अपेक्षा आहे. यासाठी, मेंदू-आधारित पॅथोफिजियोलॉजीची विस्तृत श्रेणी प्रतिबिंबित करणारे वेब-आधारित CSF बायोमार्कर ओळखण्यासाठी आम्ही AD मेंदू आणि CSF वर एक निष्पक्ष व्यापक प्रोटीओमिक्स दृष्टीकोन लागू केला. आमच्या विश्लेषणाने पाच CSF बायोमार्कर पॅनेल तयार केले, जे (i) सिनॅप्स, रक्तवाहिन्या, मायलिन, रोगप्रतिकारक आणि चयापचय बिघडलेले कार्य प्रतिबिंबित करतात; (ii) वेगवेगळ्या एमएस प्लॅटफॉर्मवर मजबूत पुनरुत्पादनक्षमता प्रदर्शित करा; (iii) एडीच्या सुरुवातीच्या आणि शेवटच्या टप्प्यात प्रगतीशील रोग-विशिष्ट बदल दर्शवा. एकूणच, हे निष्कर्ष एडी संशोधन आणि क्लिनिकल ऍप्लिकेशन्ससाठी वैविध्यपूर्ण, विश्वासार्ह, वेब-देणारं बायोमार्कर साधनांच्या विकासाच्या दिशेने एक आशादायक पाऊल दर्शवतात.
आमचे परिणाम एडी ब्रेन नेटवर्क प्रोटीओमची उच्च संरक्षित संस्था प्रदर्शित करतात आणि सिस्टम-आधारित बायोमार्कर विकासासाठी अँकर म्हणून त्याच्या वापरास समर्थन देतात. आमचे विश्लेषण असे दर्शविते की AD आणि AsymAD मेंदू असलेल्या दोन स्वतंत्र TMT-MS डेटासेटमध्ये मजबूत मॉड्यूलरिटी आहे. हे निष्कर्ष आमच्या मागील कार्याचा विस्तार करतात, फ्रंटल, पॅरिटल आणि टेम्पोरल कॉर्टेक्स (17) मधील एकाधिक स्वतंत्र कोहोर्ट्समधील 2,000 पेक्षा जास्त मेंदूच्या ऊतींचे शक्तिशाली मॉड्यूल्सचे संरक्षण दर्शवितात. हे एकमत नेटवर्क सध्याच्या संशोधनामध्ये आढळून आलेले विविध रोग-संबंधित बदल प्रतिबिंबित करते, ज्यामध्ये ग्लियाल-समृद्ध दाहक मॉड्यूल्सची वाढ आणि न्यूरॉन-समृद्ध मॉड्यूल्सची घट यांचा समावेश आहे. सध्याच्या संशोधनाप्रमाणे, या मोठ्या प्रमाणावरील नेटवर्कमध्ये AsymAD मध्ये महत्त्वपूर्ण मॉड्यूलर बदल देखील आहेत, जे विविध प्रीक्लिनिकल पॅथोफिजियोलॉजी दर्शविते (17).
तथापि, या अत्यंत पुराणमतवादी प्रणाली-आधारित फ्रेमवर्कमध्ये, अधिक सूक्ष्म जैविक विषमता आहे, विशेषत: एडीच्या सुरुवातीच्या काळात व्यक्तींमध्ये. आमचे बायोमार्कर पॅनेल AsymAD मधील दोन उपसमूहांचे चित्रण करण्यास सक्षम आहे, जे एकाधिक CSF मार्करचे महत्त्वपूर्ण विभेदक अभिव्यक्ती प्रदर्शित करतात. आमचा गट या दोन उपसमूहांमधील जैविक फरक हायलाइट करण्यात सक्षम होता, जे कोर एडी बायोमार्कर्सच्या स्तरावर स्पष्ट नव्हते. नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, या AsymAD व्यक्तींचे Aβ1-42/एकूण ताऊ गुणोत्तर असामान्यपणे कमी होते. तथापि, दोन AsymAD उपसमूहांमध्ये केवळ एकूण tau पातळी लक्षणीयरीत्या भिन्न होत्या, तर Aβ1-42 आणि p-tau स्तर तुलनेने तुलनात्मक राहिले. उच्च CSF ताऊ Aβ1-42 पातळी (7) पेक्षा संज्ञानात्मक लक्षणांचा एक चांगला अंदाज आहे असे दिसते, आम्हाला शंका आहे की दोन AsymAD गटांना रोगाच्या प्रगतीचे वेगवेगळे धोके असू शकतात. आमच्या AsymAD चा मर्यादित नमुना आकार आणि अनुदैर्ध्य डेटाची कमतरता लक्षात घेता, हे निष्कर्ष आत्मविश्वासाने काढण्यासाठी पुढील संशोधन आवश्यक आहे. तथापि, हे परिणाम सूचित करतात की प्रणाली-आधारित CSF पॅनेल रोगाच्या लक्षणे नसलेल्या अवस्थेत व्यक्तींना प्रभावीपणे स्तरीकरण करण्याची आमची क्षमता वाढवू शकते.
एकंदरीत, आमचे निष्कर्ष एडीच्या पॅथोजेनेसिसमध्ये अनेक जैविक कार्यांच्या भूमिकेचे समर्थन करतात. तथापि, अनियंत्रित ऊर्जा चयापचय ही आमच्या सर्व पाच प्रमाणित लेबलिंग पॅनेलची प्रमुख थीम बनली आहे. चयापचय प्रथिने, जसे की हायपोक्सॅन्थिन-गुआनाइन फॉस्फोरिबोसिलट्रान्सफेरेस 1 (HPRT1) आणि लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज A (LDHA), हे सर्वात मजबूत प्रमाणित सिनॅप्टिक बायोमार्कर आहेत, जे दर्शवितात की AD CSF मधील वाढ अत्यंत पुनरुत्पादक लैंगिक आहे. आमच्या रक्तवाहिन्या आणि ग्लिअल पॅनल्समध्ये ऑक्सिडेटिव्ह पदार्थांच्या चयापचयात गुंतलेले अनेक मार्कर देखील असतात. हे निष्कर्ष संपूर्ण मेंदूमध्ये चयापचय प्रक्रिया खेळत असलेल्या मुख्य भूमिकेशी सुसंगत आहेत, केवळ न्यूरॉन्सची उच्च उर्जा मागणी पूर्ण करण्यासाठीच नाही तर ॲस्ट्रोसाइट्स आणि इतर ग्लिअल पेशी (17, 48) ची उच्च ऊर्जा मागणी देखील पूर्ण करतात. आमचे परिणाम वाढत्या पुराव्यांचे समर्थन करतात की रेडॉक्स संभाव्यतेतील बदल आणि उर्जा मार्गांमध्ये व्यत्यय हा एडीच्या पॅथोजेनेसिसमध्ये समाविष्ट असलेल्या अनेक प्रमुख प्रक्रियांमधील मुख्य दुवा असू शकतो, ज्यात माइटोकॉन्ड्रियल डिसऑर्डर, ग्लिअल-मध्यस्थ दाह आणि रक्तवहिन्यासंबंधी नुकसान (49). याव्यतिरिक्त, चयापचय सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड बायोमार्कर्समध्ये आमच्या नियंत्रण आणि AD-सारख्या AsymAD उपसमूहांमध्ये मोठ्या प्रमाणात भिन्न प्रमाणात समृद्ध प्रथिने असतात, जे सूचित करतात की या उर्जेचा आणि रेडॉक्स मार्गांचा व्यत्यय रोगाच्या प्रीक्लिनिकल टप्प्यात गंभीर असू शकतो.
आम्ही पाहिलेल्या वेगवेगळ्या मेंदू आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड पॅनेलच्या ट्रेंडमध्ये देखील मनोरंजक जैविक परिणाम आहेत. न्यूरॉन्समध्ये समृद्ध सिनॅप्सेस आणि मेटाबोलोम्स एडी मेंदूमध्ये घटलेली पातळी आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये भरपूर प्रमाणात वाढ दर्शवतात. न्यूरॉन्स त्यांच्या असंख्य विशेष सिग्नल्ससाठी ऊर्जा प्रदान करण्यासाठी सिनॅप्सेसमध्ये ऊर्जा-उत्पादक मायटोकॉन्ड्रियामध्ये समृद्ध असतात (50), या दोन न्यूरॉन गटांच्या अभिव्यक्ती प्रोफाइलमध्ये समानता अपेक्षित आहे. न्यूरॉन्सचे नुकसान आणि खराब झालेल्या पेशींचे बाहेर काढणे हे मेंदू आणि CSF पॅनेलच्या नंतरच्या रोगातील ट्रेंडचे स्पष्टीकरण देऊ शकते, परंतु ते आम्ही पाहत असलेल्या सुरुवातीच्या पॅनेल बदलांचे स्पष्टीकरण देऊ शकत नाही (13). प्रारंभिक लक्षणे नसलेल्या रोगामध्ये या निष्कर्षांचे एक संभाव्य स्पष्टीकरण म्हणजे असामान्य सिनॅप्टिक छाटणी. माऊस मॉडेल्समधील नवीन पुरावे सूचित करतात की मायक्रोग्लिया-मध्यस्थ सिनॅप्टिक फॅगोसाइटोसिस AD मध्ये असामान्यपणे सक्रिय होऊ शकते आणि मेंदूमध्ये लवकर सिनॅप्स नुकसान होऊ शकते (51). ही टाकून दिलेली सिनॅप्टिक सामग्री CSF मध्ये जमा होऊ शकते, म्हणूनच आम्ही न्यूरॉन पॅनेलमध्ये CSF मधील वाढ पाहतो. रोगप्रतिकारक-मध्यस्थ सिनॅप्टिक छाटणी देखील रोगाच्या संपूर्ण प्रक्रियेदरम्यान मेंदू आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये ग्लिअल प्रोटीन्समध्ये वाढ झाल्याचे अंशतः स्पष्ट करू शकते. सिनॅप्टिक छाटणी व्यतिरिक्त, एक्सोसाइटिक मार्गातील एकूण विकृतींमुळे मेंदू आणि न्यूरोनल मार्करचे सीएसएफ अभिव्यक्ती देखील होऊ शकतात. अनेक अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की एडी मेंदूच्या पॅथोजेनेसिसमधील एक्सोसोम्सची सामग्री बदलली आहे (52). Aβ (53, 54) च्या प्रसारामध्ये बाह्य सेल्युलर मार्ग देखील सामील आहे. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की एक्सोसोमल स्राव दडपल्याने एडी ट्रान्सजेनिक माऊस मॉडेल्स (55) मध्ये AD सारखी पॅथॉलॉजी कमी होऊ शकते.
त्याच वेळी, संवहनी पॅनेलमधील प्रथिने एडी मेंदूमध्ये मध्यम वाढ दर्शविली, परंतु सीएसएफमध्ये लक्षणीय घट झाली. रक्त-मेंदू अडथळा (BBB) ​​बिघडलेले कार्य अंशतः या निष्कर्षांचे स्पष्टीकरण देऊ शकते. अनेक स्वतंत्र पोस्टमॉर्टम मानवी अभ्यासांनी एडी (56, 57) मध्ये बीबीबी ब्रेकडाउन प्रदर्शित केले आहे. या अभ्यासांनी मेंदूच्या केशिका गळती आणि रक्त-जनित प्रथिने (57) च्या पेरिव्हस्कुलर संचयनासह, एंडोथेलियल पेशींच्या या घट्ट सीलबंद थराच्या आसपासच्या विविध असामान्य क्रियाकलापांची पुष्टी केली. हे मेंदूतील भारदस्त रक्तवहिन्यासंबंधी प्रथिनांचे साधे स्पष्टीकरण देऊ शकते, परंतु सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये या समान प्रथिनांच्या क्षीणतेचे पूर्णपणे स्पष्टीकरण देऊ शकत नाही. एक शक्यता अशी आहे की वाढीव जळजळ आणि ऑक्सिडेटिव्ह तणावाची समस्या सोडवण्यासाठी मध्यवर्ती मज्जासंस्था सक्रियपणे या रेणूंना वेगळे करत आहे. या पॅनेलमधील काही अत्यंत गंभीर CSF प्रथिने, विशेषत: लिपोप्रोटीन नियमनात गुंतलेली, जळजळांच्या हानिकारक पातळीच्या प्रतिबंध आणि प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजातींच्या न्यूरोप्रोटेक्टिव्ह प्रक्रियेशी संबंधित आहे. हे पॅरोक्सोनेज 1 (PON1) साठी खरे आहे, रक्ताभिसरणातील ऑक्सिडेटिव्ह तणाव पातळी कमी करण्यासाठी जबाबदार लिपोप्रोटीन बंधनकारक एंजाइम (58, 59). अल्फा-1-मायक्रोग्लोब्युलिन/बिकुनिन प्रिकर्सर (AMBP) हे रक्तवहिन्यासंबंधी गटाचे आणखी एक लक्षणीय डाउन-रेग्युलेट मार्कर आहे. हे लिपिड ट्रान्सपोर्टर बिकुनिनचे अग्रदूत आहे, जे जळजळ दडपशाही आणि न्यूरोलॉजिकल प्रोटेक्शन (60, 61) मध्ये देखील सामील आहे.
विविध मनोरंजक गृहीतके असूनही, जैवरासायनिक रोग यंत्रणा थेट शोधण्यात अक्षमता ही शोध-चालित प्रोटीओमिक्स विश्लेषणाची एक सुप्रसिद्ध मर्यादा आहे. म्हणून, या बायोमार्कर पॅनल्समागील यंत्रणा आत्मविश्वासाने परिभाषित करण्यासाठी पुढील संशोधन आवश्यक आहे. एमएस-आधारित नैदानिक ​​विश्लेषणाच्या विकासाकडे जाण्यासाठी, भविष्यातील दिशेला मोठ्या प्रमाणात बायोमार्कर सत्यापनासाठी लक्ष्यित परिमाणात्मक पद्धतींचा वापर करणे देखील आवश्यक आहे, जसे की निवडक किंवा समांतर प्रतिक्रिया देखरेख (62). आम्ही अलीकडेच येथे वर्णन केलेल्या CSF प्रथिने बदलांचे प्रमाणीकरण करण्यासाठी समांतर प्रतिक्रिया निरीक्षण (63) वापरले. YWHAZ, ALDOA आणि SMOC1 यासह अनेक प्राधान्य पॅनेल लक्ष्ये लक्षणीय अचूकतेसह परिमाणित केली जातात, जे अनुक्रमे आमच्या सिनॅप्स, चयापचय आणि जळजळ पॅनेलला मॅप करतात (63). स्वतंत्र डेटा अधिग्रहण (DIA) आणि इतर MS-आधारित धोरणे देखील लक्ष्य पडताळणीसाठी उपयुक्त असू शकतात. बड वगैरे. (64) अलीकडेच असे दिसून आले आहे की आमच्या CSF शोध डेटा सेटमध्ये ओळखले जाणारे AD बायोमार्कर आणि स्वतंत्र DIA-MS डेटा संच यांच्यात लक्षणीय आच्छादन आहे, ज्यामध्ये तीन वेगवेगळ्या युरोपीय गटातील जवळपास 200 CSF नमुने आहेत. हे अलीकडील अभ्यास विश्वसनीय MS-आधारित शोधात रूपांतरित होण्याच्या आमच्या पॅनेलच्या संभाव्यतेस समर्थन देतात. की AD बायोमार्कर्सच्या पुढील विकासासाठी पारंपारिक प्रतिपिंड आणि ऍप्टॅमर-आधारित शोध देखील महत्त्वपूर्ण आहे. CSF च्या कमी विपुलतेमुळे, उच्च-थ्रूपुट MS पद्धती वापरून हे बायोमार्कर शोधणे अधिक कठीण आहे. NEFL आणि NRGN ही कमी-विपुलता असलेल्या CSF बायोमार्कर्सची दोन उदाहरणे आहेत, जी आमच्या सर्वसमावेशक विश्लेषणामध्ये पॅनेलमध्ये मॅप केलेली आहेत, परंतु आमच्या सिंगल एमएस स्ट्रॅटेजीचा वापर करून ते विश्वसनीयरित्या शोधले जाऊ शकत नाहीत. PEA सारख्या एकाधिक अँटीबॉडीजवर आधारित लक्ष्यीकरण धोरणे या मार्करच्या क्लिनिकल परिवर्तनास प्रोत्साहन देऊ शकतात.
एकूणच, हा अभ्यास वेगवेगळ्या प्रणालींवर आधारित CSF AD बायोमार्कर्सची ओळख आणि पडताळणीसाठी एक अद्वितीय प्रोटिओमिक्स दृष्टीकोन प्रदान करतो. अतिरिक्त AD समुह आणि MS प्लॅटफॉर्मवर या मार्कर पॅनेलचे ऑप्टिमाइझ करणे AD जोखीम स्तरीकरण आणि उपचारांना पुढे जाण्यासाठी आशादायक सिद्ध होऊ शकते. या पॅनल्सच्या अनुदैर्ध्य पातळीचे कालांतराने मूल्यमापन करणारे अभ्यास हे देखील निर्धारित करण्यासाठी महत्वाचे आहेत की कोणत्या चिन्हकांचे संयोजन लवकर रोगाचा धोका आणि रोगाच्या तीव्रतेतील बदलांना सर्वोत्तम स्तरित करते.
CSF द्वारे कॉपी केलेले 3 नमुने वगळता, या अभ्यासात वापरलेले सर्व CSF नमुने Emory ADRC किंवा जवळून संबंधित संशोधन संस्थांच्या संरक्षणाखाली गोळा केले गेले. या प्रोटीओमिक्स अभ्यासामध्ये एमोरी सीएसएफ नमुन्यांचे एकूण चार संच वापरले गेले. CSF गटामध्ये 20 निरोगी नियंत्रणे आणि 20 एडी रूग्णांचे नमुने आढळून आले. CSF कॉपी 1 मध्ये 32 निरोगी नियंत्रणे, 31 AsymAD व्यक्ती आणि 33 AD व्यक्तींचे नमुने समाविष्ट आहेत. CSF कॉपी 2 मध्ये 147 नियंत्रणे आणि 150 AD नमुने आहेत. बहु-रोग CSF प्रतिकृती 4 समूहामध्ये 18 नियंत्रणे, 17 AD, 19 ALS, 13 PD आणि 11 FTD नमुने समाविष्ट आहेत. एमोरी युनिव्हर्सिटी इन्स्टिट्यूशनल रिव्ह्यू बोर्डाने मंजूर केलेल्या करारानुसार, सर्व एमोरी अभ्यास सहभागींनी सूचित संमती प्राप्त केली. 2014 च्या नॅशनल इन्स्टिट्यूट ऑफ एजिंग बेस्ट प्रॅक्टिस गाइडलाइन्स फॉर अल्झायमर सेंटर्स (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) नुसार, सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड लंबर पंक्चरद्वारे गोळा आणि साठवले गेले. नियंत्रण आणि AsymAD आणि AD रुग्णांना Emory Cognitive Neurology Clinic किंवा Goizueta ADRC येथे प्रमाणित संज्ञानात्मक मूल्यांकन प्राप्त झाले. त्यांच्या सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमुन्यांची INNO-BIA AlzBio3 Luminex द्वारे ELISA Aβ1-42, एकूण tau आणि p-tau विश्लेषण (65) साठी चाचणी केली गेली. ELISA मूल्ये प्रस्थापित AD बायोमार्कर कट-ऑफ निकषांवर आधारित विषयांच्या निदान वर्गीकरणास समर्थन देण्यासाठी वापरली जातात (66, 67). इतर CSF निदान (FTD, ALS, आणि PD) साठी मूलभूत लोकसंख्याशास्त्रीय आणि निदान डेटा देखील Emory ADRC किंवा संलग्न संशोधन संस्थांकडून प्राप्त केला जातो. या Emory CSF प्रकरणांसाठी सारांश केस मेटाडेटा टेबल S1A मध्ये आढळू शकतो. स्विस CSF प्रतिकृती 3 कोहॉर्टची वैशिष्ट्ये पूर्वी प्रकाशित केली गेली आहेत (45).
CSF ला नमुना सापडला. CSF डेटा सेटच्या आमच्या शोधाची खोली वाढवण्यासाठी, ट्रिप्सिनायझेशनपूर्वी उच्च-विपुल प्रथिनांचा रोगप्रतिकारक वापर केला गेला. थोडक्यात, 40 वैयक्तिक CSF नमुन्यांमधून 130 μl CSF आणि उच्च सिलेक्ट टॉप14 ॲब्युडन्स प्रोटीन डिपलीशन रेजिन (थर्मो फिशर सायंटिफिक, A36372) च्या समान व्हॉल्यूम (130 μl) स्पिन कॉलममध्ये (थर्मो फिशर सायंटिफिक, A8988) खोलीत ठेवण्यात आले. तापमान उष्मायन). 15 मिनिटे फिरल्यानंतर, नमुना 1000g वर 2 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज करा. एक 3K अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगल फिल्टर उपकरण (मिलीपूर, UFC500396) 30 मिनिटांसाठी 14,000g वर सेंट्रीफ्यूग करून सांडपाण्याचा नमुना केंद्रित करण्यासाठी वापरला गेला. फॉस्फेट बफरयुक्त सलाईनसह सर्व नमुना खंड 75 μl पर्यंत पातळ करा. प्रथिने एकाग्रतेचे मूल्यमापन उत्पादकाच्या प्रोटोकॉल (थर्मो फिशर सायंटिफिक) नुसार बिसिनकोनिनिक ऍसिड (BCA) पद्धतीद्वारे केले गेले. सर्व 40 नमुन्यांमधील इम्युनोडिप्लेटेड CSF (60 μl) लाइसिल एंडोपेप्टिडेस (LysC) आणि ट्रिप्सिनसह पचले गेले. थोडक्यात, नमुना 1.2 μl 0.5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphine आणि 3 μl 0.8 M chloroacetamide 90°C वर 10 मिनिटांसाठी कमी करून अल्कायलेट करण्यात आला, आणि नंतर 15 मिनिटांसाठी वॉटर बाथमध्ये सॉनिकेटेड. नमुना 193 μl 8 M युरिया बफर [8 M युरिया आणि 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] 6 M युरियाच्या अंतिम एकाग्रतेसाठी पातळ केला गेला. LysC (4.5 μg; Wako) खोलीच्या तपमानावर रात्रभर पचनासाठी वापरले जाते. नंतर नमुना 50 एमएम अमोनियम बायकार्बोनेट (ABC) (68) सह 1 एम यूरियामध्ये पातळ केला गेला. समान प्रमाणात (4.5 μg) ट्रिप्सिन (प्रोमेगा) घाला आणि नंतर नमुना 12 तास उबवावा. 1% फॉर्मिक ऍसिड (FA) आणि 0.1% ट्रायफ्लुरोएसेटिक ऍसिड (TFA) (66) च्या अंतिम एकाग्रतेसाठी पचलेल्या पेप्टाइड द्रावणाला आम्ल बनवा, आणि नंतर वर वर्णन केल्याप्रमाणे 50 मिलीग्राम Sep-Pak C18 स्तंभ (पाणी) सह डिसॉल्ट करा (25) . पेप्टाइड नंतर 50% acetonitrile (ACN) च्या 1 मिली मध्ये उत्सर्जित केले गेले. बॅच (25) मध्ये प्रथिनांचे प्रमाण प्रमाणित करण्यासाठी, सर्व 40 CSF नमुन्यांमधील 100 μl aliquots मिश्रित नमुना तयार करण्यासाठी एकत्र केले गेले, जे नंतर पाच जागतिक अंतर्गत मानक (GIS) (48) नमुन्यांमध्ये विभागले गेले. सर्व वैयक्तिक नमुने आणि एकत्रित मानके हाय-स्पीड व्हॅक्यूम (लॅबकोन्को) द्वारे सुकवले जातात.
CSF नमुना कॉपी करते. डेयॉन आणि सहकाऱ्यांनी पूर्वी CSF कॉपी 3 नमुने (45, 46) च्या प्रतिरक्षा कमी होणे आणि पचनाचे वर्णन केले आहे. उर्वरित प्रतिकृती नमुने वैयक्तिकरित्या इम्युनोडिप्लेट केलेले नाहीत. पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे हे न काढलेले नमुने ट्रिप्सिनमध्ये डायजेस्ट करा (17). प्रत्येक पुनरावृत्ती केलेल्या विश्लेषणासाठी, प्रत्येक नमुन्यातील एल्युटेड पेप्टाइडचे 120 μl एलिकोट्स एकत्र केले गेले आणि टीएमटी-लेबल केलेले जागतिक अंतर्गत मानक (48) म्हणून वापरण्यासाठी समान व्हॉल्यूम अलिकोट्समध्ये विभागले गेले. सर्व वैयक्तिक नमुने आणि एकत्रित मानके हाय-स्पीड व्हॅक्यूम (लॅबकोन्को) द्वारे सुकवले जातात. कमी-विपुलता असलेल्या CSF प्रथिनांचे संकेत वाढविण्यासाठी, प्रत्येक नमुन्यातील 125 μl एकत्र करून, प्रत्येक प्रतिकृती विश्लेषणासाठी एक "वर्धित" नमुना तयार केला गेला [म्हणजे, एक जैविक नमुना जो संशोधन नमुन्याची नक्कल करतो, परंतु उपलब्ध रक्कम खूप मोठे (37, 69)] मिश्रित CSF नमुना (17) मध्ये विलीन केले. मिश्रित नमुना नंतर 12 मिली हाय सिलेक्ट टॉप14 ॲब्युडन्स प्रोटीन रिमूव्हल रेझिन (थर्मो फिशर सायंटिफिक, A36372) वापरून इम्यूनोरेमोव्ह केला गेला, वर वर्णन केल्याप्रमाणे पचले गेले आणि त्यानंतरच्या एकाधिक TMT लेबलिंगमध्ये समाविष्ट केले गेले.